本发明专利技术公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术对来源于Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶的234位的甲硫氨酸进行定点突变，M234I、M234A、M234L和M234V突变体对麦芽糖的受体亲和力均比野生型提高了45.6％、34.7％、30.3％和36.9％，本发明专利技术的环糊精葡萄糖基转移酶突变体能够应用于海藻糖制备中，使海藻糖的转化率得到进一步的提高。
A Mutant of Cyclodextrin Glucosyltransferase and Its Application
The invention discloses a mutant of cyclodextrin glucosyltransferase and its application, which belongs to the field of enzyme engineering technology. The methionine of 234 position of cyclodextrin glucosyltransferase from Bacillus circulans is mutant-directed. The affinity of M234I, M234A, M234L and M234V mutants to maltose is increased by 45.6%, 34.7%, 30.3% and 36.9% compared with the wild type. The cyclodextrin glucosyltransferase mutant can be used in trehalose preparation to make trehalose. The conversion rate has been further improved.
【技术实现步骤摘要】
一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体及其应用
本专利技术涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，尤其是一种在歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程
技术介绍
海藻糖(Trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性二糖，同时具有独特的高保湿性，高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖对生理功能作用的研究，现已成为国际上开发研究的主要低聚糖之一。海藻糖的合成主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。其中，以玉米淀粉为底物，使用双酶法生产海藻糖转化率高达80％以上，其作用机理为以淀粉为底物经普鲁兰酶脱支为麦芽糊精、麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α-1,4-糖苷建，通过分子内转糖苷作用将α,α-1,1-糖苷键转为α,α-1,1-糖苷键，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,1-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，具有低成本的优点。但是麦芽寡糖基海藻糖合成酶对麦芽四糖和麦芽三糖的亲和性较低，导致反应液中的小分子麦芽寡糖难以利用，使得在工业生产中淀粉底物的利用率降低，尤其是当使用大米淀粉为底物时，体系中的无法被利用的小分子糖较玉米淀粉更多，这无形之中提高了生产成本。环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextringlycosyltransfer，CGT酶，EC2.4.1.19)是一种胞外酶，同时也是一种多功能酶，能催化三种转糖基反应(歧化、环化和耦合反应)和一种水解反应。有研究表明，在多酶体系复配生产海藻糖的酶反应中，CGTase的存在可以将小分子糖的糖链接长，进而使之更容易被利用于合成海藻糖，该复配方法提高了底物利用率。而分析酶转化结果发现，反应结束后，体系中仍存在较多的麦芽糖，因此使用一种在歧化反应中对麦芽糖受体的亲和性高的CGTase能够有助于利用这一部分麦芽糖。目前国内外文献中关于CGTase对麦芽糖受体的亲和性的报道较少，仅Bacilluscirculans和Paenibacillussp.有相关报道，其中Bacilluscirculans来源的CGTase对麦芽糖的受体亲和性远高于Paenibacillussp.。若能进一步提升BacilluscirculansCGTase对麦芽糖为受体的亲和性，进一步利用体系中的麦芽糖，就可以进一步提高底物利用率，从而继续降低成本，这对海藻糖的双酶法生产具有重要意义。
技术实现思路
基于上述现状，本专利技术利用基因工程和酶工程的手段，提高环糊精葡萄糖基转移酶在歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力，进一步提高底物利用率，从而提高海藻糖的产量。本专利技术的第一个目的是提供了具有酶活提高的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，包含了将来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的环糊精葡萄糖基转移酶的第234位的氨基酸进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的环糊精葡萄糖基转移酶相比，歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力提高。在本专利技术的一种实施方式中，所述环状芽孢杆菌(B.circulans)。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于环状芽孢杆菌(B.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。编码所述来源于环状芽孢杆菌(B.circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成异亮氨酸(Ile)，突变体命名为M234I。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成丙氨酸(Ala)，突变体命名为M234A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M234L。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成缬氨酸(Val)，突变体命名为M234V。本专利技术的第二个目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，包括如下步骤：(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变，以构建含有编码突变体的基因的质粒载体。(2)将突变体质粒转化进宿主细胞。(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集发酵上清，发酵上清液即为环糊精葡萄糖基转移酶突变体的粗酶液。所述质粒载体，在本专利技术的一种实施方式中，是pET系列、pUC系列或pGEX中的任意一种。所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本专利技术的第三个目的是提供一种将环糊精葡萄糖基转移酶突变体在多酶偶联生产海藻糖中的应用。本专利技术提供了上述一种歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产海藻糖方面的应用。有益效果：本专利技术构建了一种在歧化反应中对麦芽糖的受体亲和力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体。M234I、M234A、M234L和M234V突变体对麦芽糖的受体亲和力均比野生型提高了45.6％、34.7％、30.3％和36.9％，本专利技术的环糊精葡萄糖基转移酶突变体能够应用于海藻糖制备中，使海藻糖的转化率得到进一步的提高。具体实施方式本专利技术的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：LB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。TB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O16.43，甘氨酸7.5。歧化活力测定方法：以50mmol/LpH5.5的磷酸盐缓冲液为溶剂，分别配置12mM的EPS和20mM麦芽糖溶液，各取300μL的12mMEPS和20mM麦芽糖溶液置于50℃水浴锅中预热，加入100μL稀释后的酶液，精确反应10min后，立刻煮沸10min终止反应，加入30μL稀释后的粗酶液，精确反应75min，于沸水中煮沸10min，冷却，加入100μLα-葡萄糖苷酶和100μL去离子水，混匀，于60℃水浴锅反应60min以上，加入100μL1MNa2CO3溶液，混匀，最后于400nm测定吸光值。歧化活力定义为每分钟转化一微摩尔EPS的酶量。对麦芽糖受体亲和力测定方法：用50mmol/LpH5.5磷酸缓冲液溶解底物，分别配成0.25mM，0.5mM，0.75mM，1mM，1.5mM，2mM，3mM，5mM，10mM，20mM，50mM，100mM的麦芽糖溶液，将底物置于50℃水浴锅中预热，并以此为底物，根据上述歧化活力测定方法，测定酶在此麦芽糖浓度下的歧化活力。使用GraphPadPrism软件进行拟合分析，结合拟合分析结果计算得到Km值本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，将来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的环糊精葡萄糖基转移酶的第234位的氨基酸进行取代得到的突变体。
【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，将来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的环糊精葡萄糖基转移酶的第234位的氨基酸进行取代得到的突变体。2.根据权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，所述来源于环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成异亮氨酸(Ile)，突变体命名为M234I；或，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成丙氨酸(Ala)，突变体命名为M234A；或，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为M234L；或，所述突变体是将第234位置的甲硫氨酸(Met)变成缬氨酸(Val)，突变体命名为M234V。4.编码权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，杜立，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。