一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种淀粉蔗糖酶，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术分别对来源于Deinococcus geothermalis的淀粉蔗糖酶第285位丙氨酸残基进行定点突变，对来源于Alteromonas macleodii的淀粉蔗糖酶第287位丙氨酸残基进行定点突变，对来源于Neisseria polysaccharea的淀粉蔗糖酶第295位丙氨酸残基进行定点突变。获得的单突变体酶的水解活性较野生型淀粉蔗糖酶升高。这一发明专利技术有助于对于糖苷水解酶转苷和水解机理的研究，亦可应用于糖苷水解酶工业生产多聚糖。

【技术实现步骤摘要】
一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
淀粉蔗糖酶(amylosucrase，AS)是一种葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase，E.C.2.4.1.4)，隶属于糖苷水解酶(glycosidehydrolase，GH)13家族。它的主要功能是催化合成不可溶性的多糖，在葡聚糖存在的情况下，淀粉蔗糖酶能够以普通蔗糖作为唯一的能量来源和底物来催化合成直链淀粉，是一种工业上生产多糖的应用价值极高的酶。淀粉蔗糖酶可以以廉价的蔗糖为底物生产多聚糖，而不需要例如UDP之类的昂贵的前体物质，使得工业上具有广泛的应用前景。淀粉蔗糖酶含有5个结构域(A、B、B'、C和N)，其中A、B和B'-结构域构成了淀粉蔗糖酶的催化核心。现有的淀粉蔗糖酶大多转苷能力很强，水解能力相对比较弱。研究淀粉蔗糖酶的水解和转苷作用的决定机制一直是一个热门的话题。目前，已经有许多关于水解和转苷方面的报道，但是大多集中在供体和受体位点，能显著改变水解和转苷平衡的的方法报道的还很少。因此，本专利技术通过单点突变显著提高了淀粉蔗糖酶的水解能力，说明此位点对淀粉蔗糖酶的水解和转苷作用很重要。进而该位点可以为其他淀粉蔗糖酶的水解和转苷的改造提供参考和借鉴。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种淀粉蔗糖酶的突变体，对Deinococcusgeothermalis来源的淀粉蔗糖酶的第285位丙氨基酸进行突变；或，对Alteromonasmacleodii来源的淀粉蔗糖酶第287位丙氨基酸进行突变；或，对Neisseriapolysaccharea来源的淀粉蔗糖酶第295位丙氨基酸进行突变所述突变位点与淀粉蔗糖酶的转苷作用和水解作用相关。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于Deinococcusgeothermalis的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述来源于Alteromonasmacleodii的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述来源于Neisseriapolysaccharea的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述发生突变的氨基酸位点是淀粉蔗糖酶突变体第285位或第287或第295的丙氨酸残基残基。在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶突变是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的第285位丙氨酸残基变为丝氨酸残基，突变体命名为A285S；或，所述淀粉蔗糖酶突变是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的第287丙氨酸残基变为丝氨酸残基，突变体命名为A287S；或，所述淀粉蔗糖酶突变是将氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的第295丙氨酸残基变为丝氨酸残基，突变体命名为A295S。编码所述淀粉蔗糖酶突变体的基因。携带所述淀粉蔗糖酶突变体的基因的载体。携带权所述淀粉蔗糖酶突变体的基因的重组细胞。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种淀粉蔗糖酶突变体的制备方法，包括如下步骤：(1)粉蔗糖酶酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带淀粉蔗糖酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并分别纯化淀粉蔗糖酶酶突变体A285S、A287S，A295S。所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。所述宿主细胞为细菌和真菌细胞，其也为本专利技术的保护范围。所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。所述淀粉蔗糖酶突变体在生产多聚糖的应用有益效果：本专利技术分别对来源于Deinococcusgeothermalis的淀粉蔗糖酶第285位丙氨酸残基进行定点突变，对来源于Alteromonasmacleodii的淀粉蔗糖酶第287位丙氨酸残基进行定点突变，对来源于Neisseriapolysaccharea的淀粉蔗糖酶第295位丙氨酸残基进行定点突变。获得的单突变体酶的水解率较野生型淀粉蔗糖酶均得到提高。在最优的酶转化条件下，A285S突变体的水解率是野生酶水解率的8倍，转苷率降低至野生型的32％左右；A295S突变体的水解率是野生酶水解率的6.6倍，转苷率降低至野生型的23％左右；A287S突变体的水解率是野生酶水解率的5.5倍，转苷率降低至野生型的22％左右。因此，本专利技术提供的淀粉蔗糖酶突变体A285S、A287S和A295S可以应用于糖苷水解酶工业生产多聚糖。附图说明图1野生酶以及突变体的水解率、异构率、聚合率和转苷率的HPLC检测结果。具体实施方式下述实施例中所涉及的培养基和计算方法如下：LB固体培养基：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，2％琼脂粉。LB液体培养基：5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl。水解率＝{(生成的葡萄糖含量)/(消耗的蔗糖含量-生成的果糖含量)}*100％异构率＝{(异构产物含量)/(消耗的蔗糖含量-生成的果糖含量)}*100％聚合率＝{(聚合产物含量)/(消耗的蔗糖含量-生成的果糖含量)}*100％转苷率＝异构率+聚合率实施例1：重组菌构建根据NCBI上登录号为ABF44874.1的淀粉蔗糖酶基因序列采用化学合成法合成含有淀粉蔗糖酶的DgAS基因，登录号为Q9ZEU2.1的淀粉蔗糖酶基因序列采用化学合成法合成含有淀粉蔗糖酶的NpAS基因，登录号为BAG82876.1的淀粉蔗糖酶基因序列采用化学合成法合成含有淀粉蔗糖酶的AmAS基因。将DgAS基因、NpAS基因、AmAS基因分别与pET-24a(+)质粒用NdeI和HindIII双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，得到重组细胞。将重组细胞37℃培养8h，挑取转化子在LB液体培养基(含30mg/L卡纳霉素)中震荡培养，提取质粒，酶切验证后分别得到表达质粒DgAS/pET-24a(+)、NpAS/pET-24a(+)、AmAS/pET-24a(+)。将质粒DgAS/pET-24a(+)、NpAS/pET-24a(+)、AmAS/pET-24a(+)分别转化E.coliBL21(DE3)宿主菌，涂布LB平板(含30mg/L卡纳霉素)，37℃培养8h，挑单菌落到LB液体培养基(含30mg/L卡纳霉素)中，37℃培养过夜，保存于甘油管中。分别挑取重组菌E.coliJBL21(DE3)/DgAS/pET-24a(+)、E.coliJBL21(DE3)/AmAS/pET-24a(+)、E.coliBL21(DE3)/NpAS/pET-24a(+)，于LB液体培养基(含30μg/mL卡纳霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含30μg/mL卡纳霉素)中，当光密度在600nm下达到0.6时，加当600nm处的光密度达到0.6时，加入0.4mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在25℃摇床中培养24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心20min除菌体，收集离心上清液得到野生菌粗酶液。实施例2：淀粉蔗糖酶突变体的制备(1)淀粉蔗糖酶单突变的制备根据淀粉蔗糖酶的DgAS基因序列，设计并合成引入A285S突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淀粉蔗糖酶突变体，其特征在于，对Deinococcus geothermalis来源的淀粉蔗糖酶的第285位丙氨酸进行突变；或，对Alteromonas macleodii来源的淀粉蔗糖酶第287位丙氨酸进行突变；或，对Neisseria polysaccharea来源的淀粉蔗糖酶第295位丙氨酸进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种淀粉蔗糖酶突变体，其特征在于，对Deinococcusgeothermalis来源的淀粉蔗糖酶的第285位丙氨酸进行突变；或，对Alteromonasmacleodii来源的淀粉蔗糖酶第287位丙氨酸进行突变；或，对Neisseriapolysaccharea来源的淀粉蔗糖酶第295位丙氨酸进行突变。2.根据权利要求1所述的淀粉蔗糖酶突变体，其特征在于，所述来源于Deinococcusgeothermalis的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述来源于Alteromonasmacleodii的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述来源于Neisseriapolysaccharea的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1或2所述的淀粉蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的第285位丙氨酸残基变为丝氨酸残基，突变体命名为A285S；或，所述突变是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的第287丙氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，郭志勇，祝晓蕾，徐星豪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32