【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在包含增强的寡糖转运能力的遗传工程细胞中产生一种或多种人乳寡糖(hmo)、特别是lnt和/或lnnt的方法。遗传修饰细胞包含一系列能够产生一种或多种hmo的遗传修饰，以及一系列增强乳糖和所产生hmo的转运的遗传修饰。
技术介绍
1、由于发现了人乳寡糖(hmo)在人类发育中的重要功能，因此在过去十年中，人乳寡糖(hmo)引起了极大兴趣。除了它们的益生元特性之外，hmo具有额外的积极作用，扩大了其应用领域。hmo的健康益处使其被批准用于食品(例如婴儿配方奶粉和食品)以及消费者保健产品。
2、迄今为止，至少115种hmo的结构已被确定，而且人乳汁中可能存在更多的hmo。
3、由于hmo的可用性有限，非常需要有效的商业化，即大规模生产。目前尚未提供通过化学合成实现食品和医疗应用所需的大规模生产和高质量生产。此外，hmo的化学合成途径涉及多种有毒化学品，这会给最终产物带来污染风险。
4、为了克服与hmo化学合成相关的缺点，已经开发了几种酶促方法和发酵方法。已经针对多种hmo开发了基于发酵的工艺，例如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-n-四糖、乳-n-新四糖、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖。基于发酵的工艺通常利用遗传修饰的细菌菌株，例如重组大肠杆菌(e.coli)或酵母，例如酿酒酵母(s.cerevisiae)。
5、在工程细菌菌株中生物合成生产hmo是hmo制造的一种有价值、具有成本效益且大规模适用的解决方案。它依赖于具有经修饰的代谢工程(例如修饰的糖核苷酸合成通路
6、hmo生物技术生产的最新发展使得克服细菌表达系统的某些固有局限性成为可能。例如，产生hmo的细菌细胞可以进行遗传修饰以增加细菌中有限的细胞内核苷酸糖库(wo2012112777)、以提高参与hmo生产的酶的活性(wo2016/040531)、或者以促进hmo前体的输入和合成hmo分泌到细胞外介质中(wo2010142305、wo2017042382)。此外，目的基因在重组细胞中的表达可以通过使用特定的启动子序列或其他基因表达调节因子来调节，例如最近在wo2019123324中描述的。
7、一种优化hmo生产的方法是修饰糖转运，特别是hmo前体乳糖的输入可能对hmo生产产生有利的影响，因为它是hmo生物合成的起点。这是通过大肠杆菌乳糖通透酶lacy的过表达来进行的，它代表了最深入表征的溶质转运蛋白之一(guan和kaback，annu revbiophys biomol struct.2006；35：67-91)。
8、wo2014018596建议通过修饰的乳糖分解代谢和大肠杆菌乳糖通透酶lacy的过表达来增强2’-fl、ldft、lnfp-i或lndfh-1的产生，其中lacy的表达由laclq启动子驱动，laclq启动子是一种诱导型合成启动子，其转录水平比野生型启动子高得多(penumetcha等人，bios，81(1)：7-15(2010))。这增强了细胞内乳糖和磷酸核苷酸的库，导致增强的hmo生产。
9、wo2017042382结合灭活内源β-半乳糖苷酶基因和过表达或缺失天然或异源糖流出转运蛋白以及具有功能性乳糖通透酶蛋白，以产生一种或多种hmo。具体实例表明，寡糖输出蛋白(exporter)的缺失可以增加lnt的形成。
10、ep2927316公开了从具有ptet启动子控制下的天然lacy基因和从质粒表达的yberc转运蛋白的宿主中的2’fl产生。它还公开了在乳糖存在下lacy的过表达可引起乳糖诱导的细胞应激，因此细胞已被遗传修饰以能够完全发酵目的寡糖而无需外源添加乳糖。
11、本文中，首次公开了用于产生一种或多种hmo的方法，其包括增强乳糖通透酶基因(例如内源乳糖通透酶基因)的表达与异源非lacy糖转运蛋白的表达的组合，其令人惊讶地促进优化的转运平衡，导致有效增强一种或多种hmo的产生，同时还减少副产物形成的量。
技术实现思路
1、本公开涉及一种遗传工程细胞和一种用于产生一种或多种hmo(特别是lnt和/或lnnt)的方法，其中该方法包括适当的遗传工程细胞，其中乳糖摄取系统上调与第二糖转运蛋白的表达组合，从而促进遗传工程细胞中的乳糖和/或寡糖的输入/输出以促进hmo产生。调节hmo生物合成的细胞通路中关键步骤的鉴定使得能够修饰所述通路，以通过调节代谢物和产物之间的细胞平衡来增强hmo的细胞产生。具体地，已经实现了有利的乳糖/hmo平衡的维持，其中乳糖通透酶lacy的过表达与来自mfs转运蛋白家族的另一种糖转运蛋白的组合增强了细胞产生的总体lnt和/或lnnt的水平，以及将特定hmo转运到发酵培养基中。总的来说，本专利技术促进了更可持续的制造工艺，其中在发酵中从碳源转化为hmo产物以更高的总产量进行。
2、因此，在最广泛的意义上，本公开涉及一种用于产生一种或多种hmo、特别是lnt和/或lnnt的方法，其包括提供遗传工程细胞，其中该细胞过表达一种或多种乳糖通透酶，表达选自vag、nec、fred、marc、yberc、bad以及vag、nec、fred、marc、yberc或bad中任一个的功能同源物的异源mfs转运蛋白，该功能同源物的氨基酸序列与vag、nec、fred、marc、yberc或bad中任一个具有80％同一性，并且其中该细胞还表达一种或多种选自β-1,3-glcnac-转移酶、β-1,3-gal-转移酶和β-1,4-gal-转移酶的糖基转移酶和任选的蔗糖利用系统。该方法包括在含有乳糖的合适培养基中培养所述细胞并收获所产生的一种或多种hmo。
3、在一个优选的实施方式中，本专利技术的遗传工程细胞过表达一种或多种天然乳糖通透酶。
4、一种或多种乳糖通透酶的氨基酸序列选自seq id no 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16[lacy变体]以及作为功能同源物并与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16[lacy变体]中任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列。
5、在目前优选的实施方式中，一种或多种过表达的乳糖通透酶与seq id no:1[lacyk-12]相同或与seq id no:1[lacy k-12]具有至少70％同一性。遗传工程细胞可包含至少一种编码乳糖通透酶的核酸序列，或其可包含多于一种编码一种或多种乳糖通透酶的核酸序列。编码乳糖通透酶的核酸序列优选是遗传工程细胞的天然基因，其可以由重组核酸序列编码。
6、异源mfs转运蛋白选自seq id no:62[vag]、63[fred]、64[marc]、65[bad]、66[nec]、67[yberc]以及seq id no:62[vag]、63[fred]、64[marc]、65[b本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于产生一种或多种HMO的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的用于产生一种或多种HMO的方法，其中所述遗传工程细胞表达蔗糖利用系统。
3.根据权利要求2所述的用于产生一种或多种HMO的方法，其中所述蔗糖利用系统是能够将蔗糖水解成葡萄糖和果糖的多肽，其选自SEQ ID NO:86[SacC_Agal，糖苷水解酶家族32蛋白，WP_103853210.19]、SEQ ID NO:87[Bff，β-呋喃果糖苷酶蛋白，BAD18121.1]、或SEQID NO:11和SEQ ID NO:12中任一个的功能同源物，所述功能同源物的氨基酸序列与SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12中任一个具有至少80％同一性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种乳糖通透酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16[LacY变体]以及作为功能同源物并与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16[LacY变体
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种乳糖通透酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相同，或与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MFS转运蛋白是Nec、Vag和/或YberC。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-1,3-Gal-转移酶或β-1,4-gal-转移酶分别选自CvB3galT和GalTK或GalT以及CvB3galT、GalTK或GalT中任一个的功能同源物，所述功能同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:17[CvB3galT]、SEQ ID NO:18[GalTK]和SEQ ID NO:19[GalT]中任一个具有至少70％同一性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-1,3-GlcNAc-转移酶选自LgtA、PmnagT、HD0466以及LgtA、PmnagT或HD0466中任一个的功能同源物，所述功能同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:20[LgtA]、SEQ ID NO:21[PmnagT]或SEQ ID NO:22[HD0466]中任一个具有至少70％同一性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述遗传工程细胞表达一种或多种参与活化糖核苷酸生物合成的多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种参与活化糖核苷酸生物合成的多肽选自Pgm[SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44]、GalU[SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46]、GalE[SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48]、GlmM[SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50]、GlmU[SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52]、GlmS[SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:54]，及其氨基酸序列与SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54中任一个具有至少70％同一性的功能同源物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述遗传工程细胞包含多于一种编码根据权利要求4或5所述的一种或多种乳糖通透酶的核酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳糖通透酶、MFS转运蛋白、糖基转移酶、蔗糖利用系统和参与活化糖核苷酸生物合成的多肽中的任意一种或多种由遗传工程宿主细胞中的一种或多种核酸序列编码，并且其中所述一种或多种核酸序列由一种或多种调节元件调节。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种调节元件包含核酸序列如表8所示的一个或多个启动子序列，优选地启动子序列选自SEQ ID NO:70(PglpF)或SEQ ID NO:68(Plac)或SEQ ID NO:69(PgatY_70UTR)、SEQ ID NO:82(PmglB_UTR70)或SEQ ID NO:100(PglpA_70UTR)或SEQ ID NO:101(PglpT_70UTR)或cp6(SEQ ID NO:84)或Posmy(SEQ IDNO:85)或这些的变体。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述核酸序列整合到所述遗传工程细胞的基因组中。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述遗传工程细胞是细菌或酵母细胞。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于产生一种或多种hmo的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的用于产生一种或多种hmo的方法，其中所述遗传工程细胞表达蔗糖利用系统。
3.根据权利要求2所述的用于产生一种或多种hmo的方法，其中所述蔗糖利用系统是能够将蔗糖水解成葡萄糖和果糖的多肽，其选自seq id no:86[sacc_agal，糖苷水解酶家族32蛋白，wp_103853210.19]、seq id no:87[bff，β-呋喃果糖苷酶蛋白，bad18121.1]、或seqid no:11和seq id no:12中任一个的功能同源物，所述功能同源物的氨基酸序列与seq idno:11或seq id no:12中任一个具有至少80％同一性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种乳糖通透酶的氨基酸序列选自seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16[lacy变体]以及作为功能同源物并与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16[lacy变体]中任一个具有至少70％同一性的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种乳糖通透酶的氨基酸序列与seq id no:1相同，或与seq id no:1具有至少70％同一性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mfs转运蛋白是nec、vag和/或yberc。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-1,3-gal-转移酶或β-1,4-gal-转移酶分别选自cvb3galt和galtk或galt以及cvb3galt、galtk或galt中任一个的功能同源物，所述功能同源物的氨基酸序列与seq id no:17[cvb3galt]、seq id no:18[galtk]和seq id no:19[galt]中任一个具有至少70％同一性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-1,3-glcnac-转移酶选自lgta、pmnagt、hd0466以及lgta、pmnagt或hd0466中任一个的功能同源物，所述功能同源物的氨基酸序列与seq id no:20[lgta]、seq id no:21[pmnagt]或seq id no:22[hd0466]中任一个具有至少70％同一性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述遗传工程细胞表达一种或多种参与活化糖核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·帕帕扎基斯，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：
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