木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及具有提高的催化活性的木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、含有该DNA分子的重组菌株及它们的应用。通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建的含有该木糖异构酶突变体的重组酵母可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。因此，本发明专利技术的木糖异构酶突变体及重组菌株在化工、能源、食品、医药等领域具有广泛应用价值，可高效地进行糖‑醇转化发酵。

Xylose isomerase mutants, DNA molecules encoding the enzyme, recombinant strains introducing the DNA molecules and their applications

The present invention relates to xylose isomerase mutants with enhanced catalytic activity, DNA molecules encoding the enzyme, recombinant strains containing the DNA molecules and their applications. Mutagenesis of amino acid residues at specific sites in natural xylose isomerase can lead to a mutant of xylose isomerase with enhanced catalytic activity, and the mutant of xylose isomerase has high thermal stability; furthermore, the recombinant yeast containing the mutant of xylose isomerase constructed by synthetic biology method can be effectively used for co-fermentation of C5 and C6 sugars to produce ethyl. Alcohol, fermentation efficiency and ethanol yield were significantly improved. Therefore, the xylose isomerase mutant and the recombinant strain of the invention have wide application value in chemical industry, energy, food, medicine and other fields, and can efficiently carry out sugar and alcohol conversion and fermentation.

【技术实现步骤摘要】
木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用
本专利技术涉及蛋白质工程和基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及具有提高的催化活性的木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用。
技术介绍
木糖异构酶(Xyloseisomerase，XI；EC5.3.1.5)能够催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在微生物体内的糖代谢过程中起着重要作用，也具有极其广阔的工业应用价值。特别地，在天然微生物中，存在两种将木糖代谢为木酮糖的途径，包括经由木糖异构酶的途径以及经由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的途径。在细菌(如密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、锈赤霉链霉菌(Streptomycesrubiginosus)、节杆菌属(Arthrobactersp.)和大肠埃希氏菌(Escherichiacoli))、少数真菌(如梨囊鞭菌属(Piromyces)和根囊鞭菌属(Orpinomyces))以及植物(如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大麦(Hordeumvulgare)和水稻(Oryzasativa))等中，通过木糖异构酶的作用，仅需一步反应即可将木糖直接异构化为木酮糖。在纤维素乙醇菌株开发中，菌株对木糖的利用及转化为乙醇的能力是最为关键的。利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖来生产乙醇的重组菌株成为研究热点。就此而言，一方面，迄今为止在酵母、特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中能够表达出的具有活性的木糖异构酶较少；另一方面，在木糖代谢途径中，木糖异构酶为关键限速酶，直接影响木糖在酵母中的代谢速度。因此，新型木糖异构酶的开发和分子改造尤为重要。源于真菌及嗜热细菌的木糖异构酶能够在酵母中表达并显示出活性，并参与酵母木糖代谢途径的构建。基于木糖异构酶特定的催化机理进行理性设计并提高其催化效率，对构建新型高效利用木糖的重组酵母而言具有重要的应用意义和价值。然而，如何有效地得到具有提高的催化活性的木糖异构酶并将其在工业生产中加以应用，在本领域中仍罕有报道，不能满足实际需求。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人通过研究发现，通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建的含有该木糖异构酶突变体的重组酵母可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。因此，根据第一方面，本专利技术提供了木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体在天然木糖异构酶氨基酸序列(SEQIDNo.13)中引入了如下突变中的一种或多种：Ala144Thr、Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。在一些优选实施方式中，所述木糖异构酶突变体具有选自于如下氨基酸序列中任一者的氨基酸序列：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5以及SEQIDNo.6。根据第二方面，本专利技术提供了编码如第一方面所述的木糖异构酶突变体的DNA分子。在一些优选实施方式中，所述DNA分子具有选自于如下核苷酸序列中任一者的核苷酸序列：SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11以及SEQIDNo.12。根据第三方面，本专利技术提供了导入如第二方面所述的DNA分子的重组菌株。在一些优选实施方式中，所述重组菌株是重组酵母菌株。根据第四方面，本专利技术提供了如第一方面所述的木糖异构酶突变体、如第二方面所述的DNA分子以及如第三方面所述的重组菌株在C5糖和C6糖共发酵产乙醇中的用途。有益效果本专利技术的木糖异构酶突变体可以将木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等单糖异构化，转化为细菌、酵母、真菌等微生物可以利用的糖类，并通过自身代谢途径或通过代谢工程途径转化为3-磷酸甘油醛、丙酮酸或乙酰辅酶A等代谢中间体；进而，3-磷酸甘油醛、丙酮酸或乙酰辅酶A等代谢中间体经过宿主本身的代谢，可发酵为具有工业应用价值的化合物单体，如乳酸、乙醇、丁酸、丁醇、戊二醇等化合物。另一方面，本专利技术的重组菌株在以木糖或葡萄糖-木糖为碳源的合成培养基中进行发酵实验时，24h内木糖利用率达到99％，总糖醇转化率达到90％以上；在应用于秸秆酶解液的C5糖和C6糖共发酵产乙醇时，木糖利用率为91.24％，葡萄糖-木糖混合糖转化为乙醇的转化率为87.32。因此，本专利技术的木糖异构酶突变体及重组菌株在化工、能源、食品、医药等领域具有广泛应用价值，可高效地进行糖-醇转化发酵。附图说明图1：本专利技术的木糖异构酶突变体的蛋白电泳胶图。图2：本专利技术的木糖异构酶突变体的诱导发酵酶活。图3：本专利技术的木糖异构酶突变体和天然木糖异构酶活性对比。图4：本专利技术的重组酿酒酵母0918MUT和对照重组酿酒酵母0918WT在含有40g/L木糖作为碳源的培养基中的生长曲线对比。图5：本专利技术的重组酿酒酵母0918MUT和对照重组酿酒酵母0918WT在含有40g/L木糖作为碳源的培养基中的发酵曲线对比。图6：本专利技术的重组酿酒酵母0918MUT在含有80g/L葡萄糖和40g/L木糖作为碳源的培养基中的发酵曲线。图7：本专利技术的重组酿酒酵母0918MUT在秸秆酶解液中的发酵曲线。具体实施方式根据已发表的文献中对XI序列的同源性分析的报道，木糖异构酶可分为两大类：I类木糖异构酶通常含有约390个残基，序列同源性超过50％；II类木糖异构酶则含有约440个残基。与I类木糖异构酶相比，II类木糖异构酶在N-末端明显延长了约50个氨基酸残基；同时，二者的C-末端结构也有较大差异。本专利技术所针对的木糖异构酶属于II类木糖异构酶。在本专利技术中，所使用的天然木糖异构酶来源于Metagenomicinsightsintothecarbohydrate-activeenzymescarriedbythemicroorganismsadheringtosoliddigestaintherumenofcows，LinglingWang等，PLOSONE，November2013，Volume8，Issue11，e78507。该天然木糖异构酶的氨基酸序列全长共包含439个氨基酸(SEQIDNo.13)。为改善蛋白质的期望性质，可对蛋白质进行理性设计，而蛋白质的理性设计通常基于其晶体结构。通过在ProteinDataBank(PDB)中进行序列比对，得到了在2015年底报道的序列一致性为75％、相似性为83％的晶体结构(PDBID：4XKM)。晶体结构显示，该XI为同源四聚体且亚基之间没有二硫键；每个亚基的催化结构域折叠成αβ桶：折叠成桶状的平行β片层被位于桶外沿的α螺旋连接，活性中心处于连接β片层羧端与α螺旋羧端8段环链构成的一个漏斗状空腔的底部。根据已发表的文献报道，在木糖作为底物参与木糖异构酶催化反应的过程中，采取“open-chainconformation”，即开环构象，而并非游离单糖状本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体在如SEQ ID No.13所示的天然木糖异构酶氨基酸序列中引入了如下突变中的一种或多种：Ala144Thr、Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。

【技术特征摘要】
1.一种木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体在如SEQIDNo.13所示的天然木糖异构酶氨基酸序列中引入了如下突变中的一种或多种：Ala144Thr、Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。2.如权利要求1所述的木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体具有选自于如下氨基酸序列中任一者的氨基酸序列：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5以及SEQIDNo.6。3.编码如权利要求1或2所述的木糖异构酶突变体的DNA分子。4.如权利要求3所述的DNA分子，其中，所述DNA分子具有选自于如下核苷酸序列中任一者的核苷酸序列：SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11以及SEQIDNo.12。5.导入如权利要求3或4所述的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟毅，张子剑，贾力耕，沈乃东，何太波，宋思琦，苏立国，张媛，王靖，张广昊，吴延东，李义，袁敬伟，
申请(专利权)人：吉林中粮生化有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，中粮生化能源肇东有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22