一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌技术

本发明专利技术公开了一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。本发明专利技术提供的第一种生产葡萄糖醛酸的方法(方法甲)包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的。本发明专利技术提供的第二种生产葡萄糖醛酸的方法(方法乙)包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸。所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。本发明专利技术对于葡萄糖醛酸生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。

A Method for Producing Glucuronic Acid and Its Specialized Engineering Bacteria

The invention discloses a method for producing glucuronic acid and a special engineering bacteria. The first method for producing glucuronic acid (method A) provided by the invention comprises the following steps: using inositol as raw material to produce glucuronic acid under the action of Engineering bacteria; the engineering bacteria are recombinant bacteria expressing functional proteins, which are obtained by introducing functional genes encoding the functional proteins into the starting bacteria. The second method for producing glucuronic acid (method B) provided by the invention comprises the following steps: using inositol as raw material, under the action of functional protein, to produce glucuronic acid. The functional proteins are as follows: (a1) or (a2) or (a3): (a1) the protein shown in sequence 3 of the sequence list; (a2) the fusion protein obtained from the N-terminal or/or C-terminal ligation tag of (a); and (a3) the protein shown in sequence 7 of the sequence list. For the production of glucuronic acid, the invention will produce enormous economic benefits and has great popularization and application value.

【技术实现步骤摘要】
一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。
技术介绍
葡萄糖醛酸(D-glucuronicacid)是葡萄糖C-6位的羟基被氧化成羧基所形成的糖醛酸，其分子式为C6H10O7，分子量为194.14。葡萄糖醛酸是白色针状结晶或粉末，熔点155℃-157℃，其结构示意图见图1。葡萄糖醛酸广泛存在于植物、动物中，很少以游离形式存在于自然界。葡萄糖醛酸不仅是传统的肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，而且是合成许多医药的重要中间体，常用作功能性饮料、减肥药、化妆品等的添加剂。肌醇(myo-inositol)，又称环己六醇(cyclohexanhexol)，分子式为C6H12O6，分子量为180，其结构示意图见图2。几乎所有生物都含有游离态或结合态的肌醇。目前肌醇的生产方法有水解法，微生物法、化学合成法以及离子交换法。水解法是生产肌醇最主要的方法，主要以米糠、玉米糠等为原材料提取得到。目前，葡萄糖醛酸的生产主要主要有以下几种方法：①生物发酵法：利用相关的生物菌株进行发酵，从而合成葡萄糖醛酸。人类羊膜中存在UDP-葡萄糖脱氢酶，可以催化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸，UDP-葡萄糖醛酸在相关酶的作用下进一步合成葡萄糖醛酸。②多糖水解法：通过水解含糖醛酸的多糖，从而得到葡萄糖醛酸。主要包括水解太阳花膜的半纤维素，碱法水解棉花和纤维素，热水萃取半纤维素等方法。③化学氧化法：目前生产葡萄糖醛酸的主要方法，主要包括无机氧化法和催化氧化法两种。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。综上所述，本领域迫切需要开发一种新的高效生产葡萄糖醛酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产葡萄糖醛酸的方法及其专用工程菌。本专利技术提供的第一种生产葡萄糖醛酸的方法(方法甲)，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的。所述工程菌为胞内表达功能蛋白的重组菌。所述出发菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BW25113。所述功能基因具体通过重组质粒导入出发菌。所述重组质粒可为将所述功能基因插入出发载体得到的重组质粒。所述出发载体可为载体pBAD/HisB。所述重组质粒具体可为将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。所述方法甲中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。所述方法甲中，反应温度为37℃、反应pH为8.5。所述方法甲中，反应时间可为8-12小时。所述方法甲中，反应时间可为10小时。所述方法甲中的工程菌为进行诱导培养后的工程菌。所述诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。所述方法甲包括如下步骤：培养所述工程菌并在培养过程中进行L-阿拉伯糖诱导，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体和肌醇，进行反应，得到葡萄糖醛酸。菌体和肌醇的质量配比为：10：18。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、肌醇18g/L。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的硼酸盐缓冲液。所述方法甲具体包括如下步骤：在含50μg/mL链霉素的液体LB培养基中培养所述工程菌至OD600nm＝0.6-0.8，然后加入L-阿拉伯糖并使其在培养体系中的浓度为0.2g/100mL，30℃、200rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；在缓冲体系中，加入所述菌体、肌醇和TritonX-100，进行反应，得到葡萄糖醛酸。菌体和肌醇的质量配比为：10：18。反应体系中，各组分的初始浓度如下：菌体10g/L、肌醇18g/L、TritonX-1000.1％(体积百分含量)。菌体质量为湿重。所述缓冲体系为50mM的硼酸盐缓冲液。本专利技术提供的第二种生产葡萄糖醛酸的方法(方法乙)，包括如下步骤：以肌醇为原料，在功能蛋白的作用下，生产葡萄糖醛酸。所述方法乙中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。所述方法乙中，反应温度为37℃、反应pH为8.0。所述方法乙中，反应时间可为20-40min。所述方法乙中，反应时间可为30min。所述方法乙包括如下步骤：在缓冲体系中加入功能蛋白、L-半胱氨酸、肌醇和二价铁化合物，进行反应，得到葡萄糖醛酸。功能蛋白和肌醇的配比为：1×105μg功能蛋白：20mmol肌醇。功能蛋白、L-半胱氨酸、肌醇和二价铁化合物的配比为：1×105μg功能蛋白：2mmolL-半胱氨酸：20mmol肌醇：1mmol二价铁化合物。反应体系中，各组分的初始浓度如下：功能蛋白100μg/mL，L-半胱氨酸2mmol/L，肌醇20mmol/L，Fe2+1mmol/L。所述二价铁化合物具体为硫酸亚铁。所述缓冲体系为pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。本专利技术还保护一种重组菌，是将重组质粒导入出发菌得到的；所述重组质粒为将编码功能蛋白的功能基因导入出发载体得到的；所述出发载体为pBAD/HisB载体；所述出发菌为大肠杆菌BW25113。所述重组质粒具体可为将DNA分子乙(DNA分子乙为双链DNA分子，自上游至下游依次由核苷酸C和序列表的序列4所示核苷酸组成)插入载体pBAD/HisB的XhoI和EcoRI酶切位点之间得到的重组质粒。本专利技术还保护所述重组菌在制备葡萄糖醛酸中的应用。所述应用中，以肌醇为原料。本专利技术还保护功能蛋白在制备葡萄糖醛酸中的应用。所述应用中，以肌醇为原料。以上任一所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。以上任一所述功能基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；(b2)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码具有将肌醇转化为葡萄糖醛酸的能力的蛋白质的DNA分子；(b4)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有将肌醇转化为葡萄糖醛酸的能力的蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。本专利技术提供了功能蛋白的新用途，以肌醇为原料生产葡萄糖醛酸。相应的，本专利技术提供了表达所述功能蛋白的重组菌，该重组菌可以以全细胞的方式，以肌醇为原料生产葡萄糖醛酸。本专利技术对于葡萄糖醛酸生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大推广应用价值。附图说明图1为葡萄糖醛酸的结构示意图。图2为肌醇的结构示意图。图3为肌醇标准品和葡萄糖醛酸标准品的HPLC检测图谱。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的硼酸盐缓冲液均为50m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产葡萄糖醛酸的方法，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种生产葡萄糖醛酸的方法，包括如下步骤：以肌醇为原料，在工程菌的作用下，生产葡萄糖醛酸；所述工程菌为表达功能蛋白的重组菌，是将编码所述功能蛋白的功能基因导入出发菌得到的；所述功能蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表的序列3所示的蛋白质；(a2)在(a)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；(a3)序列表的序列7所示的蛋白质。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应温度为30℃-40℃、反应pH为8.0-9.0。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中的工程菌为进行诱导培养后的工程菌；所述诱导培养为采用L-阿拉伯糖进行诱导并培养。4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述出发菌为大肠杆菌。5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述功能基因通过重组质粒导入出发菌；所述重组质粒是将所述功能基因插入出发载体得到的。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述出发载体为pBAD/HisB载体。7.一种生...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡美荣，王雷，滕斐，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11