双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-1 scFv-CAR-T及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种双特异性嵌合抗原受体hc‑Met scFv‑PD‑1scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ及其构建方法和应用，该嵌合抗原受体由抗人肝细胞生长因子受体(c‑Met)单克隆抗体轻链和重链可变区(c‑Met scFv)、抗人程序性死亡1受体(PD‑1)单克隆抗体轻链和重链可变区(PD‑1 scFv)、人程序性死亡1受体(PD‑1)胞外配体结合区、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人CD137和CD3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)用于制备实体肿瘤免疫治疗制剂，尤其是能用于表面c‑Met及PD‑L1阳性的肿瘤治疗制剂。

Bispecific chimeric antigen receptor c-Met/PD-1 scFv-CAR-T and its construction method and Application

The invention belongs to the field of biotechnology and relates to a bispecific chimeric antigen receptor hc_Met_scFv_PD_1scFv_CD8alpha_CD28_CD137_CD3 and its construction method and application. The chimeric antigen receptor is composed of light chain and heavy chain variable region (c_Met) of monoclonal antibody against human hepatocyte growth factor receptor (c_Met), and anti-human programmed death receptor (PD_1) monoclonal antibody light chain and heavy chain antibody. Chain variable region (PD_1 scFv), extracellular ligand binding region of human programmed death 1 receptor (PD_1), hinge region of human CD8alpha, transmembrane and intracellular region of human CD28, and intracellular structure of human CD137 and CD3 were constructed in series. The chimeric antigen receptor is used to modify T lymphocytes, and the modified T cells (CAR T cells) are used to prepare solid tumor immunotherapy preparations, especially those with C Met and PD L1 positive surface.

【技术实现步骤摘要】
双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-1scFv-CAR-T及其构建方法和应用
本专利技术属生物
，涉及抗原受体c-Met/PD-1scFv-CAR-T及其构建方法，具体涉及双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-1scFv-CAR-T及其构建方法和应用。本专利技术利用基因工程技术获得含双特异性重组嵌合抗原受体的融合基因，感染T细胞后使T细胞表达该双特异性嵌合抗原受体。该双特异性嵌合抗原受体T细胞能够识别肿瘤细胞表面的c-Met及阻断激活T细胞表面的抑制性受体PD-1，避免激活T细胞被诱导凋亡，保持持续激活能力，从而特异性杀伤c-Met阳性的肿瘤细胞，可应用于实体肿瘤的免疫治疗。
技术介绍
现有技术公开了正常的免疫反应过程中，未致敏T细胞至少需要两种信号的刺激才能够被激活并产生特异性免疫应答；其中第一个信号是T细胞借助T细胞受体(TCR)识别与MHC-I或II类分子结合的抗原，通过TCR/CD3复合体传递抗原识别信号；第二个信号是以CD28为主的T细胞表面受体分子识别抗原提呈细胞(APC)或其他细胞表面的共刺激分子，传递协同刺激信号。研究表明，肿瘤特异性T细胞在机体清除肿瘤细胞的免疫反应中发挥主要作用，同时肿瘤细胞通过抑制参与T细胞识别及抗原反应的分子表达、降低免疫原性等途径产生免疫逃逸，从而使机体的免疫系统不能发挥清除肿瘤细胞的作用。有研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α、β链可变区，并将scFv直接和共刺激分子(如CD28、CD137等)以及T细胞信号传导区域CD3ζ连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞活化的第一、第二信号，促进T细胞活化、增殖，从而特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。目前，CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤治疗中取得显著疗效，但在实体瘤的临床应用上却面临着诸多挑战。主要障碍之一是由于实体肿瘤的免疫抑制微环境，即通过上调抑制性受体来抑制肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和基因工程修饰T细胞的功能，特别是免疫抑制性受体PD-1的上调。PD-1是目前研究的最多的一个免疫抑制性受体，其表达在T细胞和前体B细胞表面，属于免疫球蛋白超家族的一员。PD-L1是目前已发现的PD-1主要配体，研究发现PD-L1在多种肿瘤细胞膜表面的表达水平升高，肿瘤细胞巧妙地利用PD-L1去结合T细胞表面的PD-1受体来传递抑制性信号，从而导致免疫逃逸。有临床前研究和临床试验均指出，采用PD-L1或PD-1阻断抗体来增强癌症患者的抗肿瘤免疫应答可作为一种新型的肿瘤免疫治疗手段，并且能够获得持续性的临床应答。此外，有研究提示，CAR-T细胞治疗联合抗PD-1抗体可以大大增强CAR-T细胞的抗肿瘤效应，那么在CAR-T细胞膜表面表达PD-1-scFv-CAR融合受体，即采用PD-1scFv封闭CAR-T细胞表面的PD-1受体，从而避免PD-L/PD-1的抑制信号，增强CAR-T细胞治疗的效用？利用抗c-MetscFv和抗PD-1scFv构建的双特异性嵌合抗原受体hc-MetscFv-Linker-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ表达于T细胞表面，可使T细胞特异性杀伤c-Met阳性的肿瘤细胞，同时封闭T细胞表面的抑制性受体PD-1，使T细胞持续激活，因此双特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞有望打破过继传输T细胞治疗中的PD-L/PD-1的免疫抑制信号轴，在实体肿瘤免疫治疗领域具有广阔的应用前景。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-1scFv-CAR-T及其构建方法和用于实体肿瘤的免疫治疗中的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是要解决现有技术存在的技术问题，提供一种双特异性嵌合抗原受体c-Met/PD-1scFv-CAR-T及其构建方法和用于实体肿瘤的免疫治疗中的用途。本专利技术构建了一种抗hc-MetscFv-PD-1scFv的嵌合抗原抗受体(hc-MetscFv-Linker-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ)，表达该嵌合抗原受体的T细胞具有其独特性，经实验证实其对肿瘤细胞特异性杀伤功能，具有临床治疗中的应用前景。本专利技术利用基因工程技术获得一种含双特异性重组嵌合抗原受体hc-MetscFv-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体系统，通过对慢病毒进行包装获得含病毒的上清，感染T细胞，使T细胞表达该双特异性嵌合抗原受体。这种双特异性嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)能够识别肿瘤细胞表面的c-Met及阻断激活T细胞表面的抑制性受体PD-1，避免激活T细胞被诱导凋亡，保持持续激活能力，从而特异性杀伤c-Met阳性的肿瘤细胞，可应用于实体肿瘤的免疫治疗。更具体的，本专利技术采用的技术方案是：双特异性嵌合抗原受体hc-MetscFv-Linker-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ，所述嵌合抗原受体由抗人c-Met及PD-1单克隆抗体轻链和重链可变区hc-MetscFv、PD-1scFv、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人CD137及CD3ζ胞内区结构串联构成；所述双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；所述双特异性嵌合抗原受体的核酸序列如SQEIDNO.2所示；所述双特异性嵌合抗原受体含有针对人c-Met抗原的单链抗体hc-MetscFv，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，单链抗体的重链和轻链之间用15个氨基酸的连接短肽连接；所述嵌合抗原受体含有针对人c-Met抗原的单链抗体hc-MetscFv，其核酸序列如SEQIDNO.4所示；所述嵌合抗原受体含有针对人PD-L1的受体PD-1胞外结合区，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；所述嵌合抗原受体含有针对人PD-L1的受体PD-1胞外结合区，其核酸序列如SEQIDNO.6所示；所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8α信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO.7所示；所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8α信号肽，其核酸序列如序列表中的SEQIDNO.8所示。本专利技术进一步提供了所述的双特异性抗原受体hc-MetscFv-Linker-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤免疫治疗中的应用。本专利技术采用抗人c-MetscFv及PD-1scFv氨基酸序列，将其进行密码子优化，从NCBIGenBank数据库中搜索到人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因、CD137以及CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成CD8α信号肽、CD8α-CD28-CD137-CD3ζ基因片段，然后通过重组酶连接成双特异性嵌合抗原受体hc-Metscfv-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ，插入到慢病毒表达载体pKC-EF1α-DS-Red(pKC-空载体)中，构建抗人c-Met/PD-1scFv-CAR表达载体(如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.双特异性嵌合抗原受体hc‑Met scFv‑PD‑1 scFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体由抗人c‑Met单克隆抗体轻链和重链可变区hc‑Met scFv、抗人PD‑1单克隆抗体轻链和重链可变区hPD‑1 scFv、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人CD137和CD3ζ胞内区结构串联构成；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.双特异性嵌合抗原受体hc-MetscFv-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体由抗人c-Met单克隆抗体轻链和重链可变区hc-MetscFv、抗人PD-1单克隆抗体轻链和重链可变区hPD-1scFv、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人CD137和CD3ζ胞内区结构串联构成；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hc-MetscFv-PD-1scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体由抗人c-Met单克隆抗体轻链和重链可变区hc-MetscFv、抗人PD-1单克隆抗体轻链和重链可变区hPD-1scFv、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人CD137和CD3ζ胞内区结构串联构成，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hc-MetscFv--CD8α-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有针对人c-Met抗原的单链抗体hc-MetscFv，其氨基酸序列如SEQIDNO.3，单链抗体的轻链和重链之间用连接短肽Gly4Ser连接。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体hc-MetscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有针对...

【专利技术属性】
技术研发人员：于敏，孙祖俊，王羽雄，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31