一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，所述融合蛋白具有优化的式I所示结构：X1‑X2‑L1‑X3‑X4‑X5(I)，其中各元件如说明书所述。实验结果表明，本发明专利技术所提供的经所述融合蛋白修饰的特定NK细胞(如LaA‑CAARNK92MI细胞)能靶向治疗La/SSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，并且具有疗效好、副作用小、生产成本低等诸多优点。

A NK cell modified with anti-La/SSB chimeric antigen, its preparation method and Application

The invention relates to a NK cell modified with anti-La/SSB chimeric antigen, a preparation method and application thereof. Specifically, the present invention provides a fusion protein anti-La/SSB chimeric antigen modification and NK cells expressing the fusion protein. The fusion protein has an optimized structure as shown in formula I: X1 X2 L1 X3 X4 X5 (I), in which the components are described in the specification. The experimental results show that the specific NK cells modified by the fusion protein (such as LaA_CAARNK92MI cells) provided by the invention can target the autoimmune diseases with positive La/SSB autoantibodies, and have many advantages such as good curative effect, small side effects, low production cost, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用
本专利技术属于生物医药领域，具体地说，本专利技术涉及一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用。
技术介绍
自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，其最显著的特点是B细胞过度反应，产生高滴度的自身抗体和全身炎症反应，这些最终导致各种器官的病变。近期，人们越来越意识到B细胞在自身免疫性疾病的发生发展中起到越来越广泛的作用，这为B细胞靶向治疗自身免疫性疾病提供了令人振奋人心的前景。其中CD20靶向的B细胞耗竭实验表明，95％的天疱疮(PV)病人出现短期的疾病衰退，但是81％的病人复发并出现致命的感染。CD20靶向的B细胞耗竭之后，患者血清中自身抗体滴度明显降低，这预示着在天疱疮疾病中，短寿命的浆细胞是自身抗体的来源，并且靶向CD20阳性的记忆性B细胞前体间接性的杀死了分泌自身抗体的浆细胞。为了能够在治疗天疱疮的同时又不引发广泛的免疫抑制，抗Dsg3B细胞受体作为胞外片段，与相应的信号区域融合，构建的anti-Dsg3CAAR-T在天疱疮小鼠模型中取得了较好的实验结果。然而，一些其它的自身免疫性疾病(如红斑狼疮)的病因非常复杂，并且自身免疫性疾病患者本身的免疫系统是紊乱的，T细胞功能异常，Th细胞控制耐受，B细胞过度反应，自身免疫潜能细胞(PAL)大多处于未活化或者活性封闭状态。所以自体性嵌合体抗原受体(CAR)T细胞治疗困难重重，达不到理想的状态，而异体性CAR-T细胞移植存在移植物抗宿主反应的风险。因此，本领域迫切需要探索靶向治疗自身免疫性疾病的新策略，能在治疗自身免疫疾病的同时不引发广泛的免疫抑制、移植物抗宿主反应风险小、生产成本低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，能靶向治疗自身免疫疾病，同时不引发广泛的免疫抑制、移植物抗宿主反应风险小、生产成本低。本专利技术的第一方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所述结构：X1-X2-L1-X3-X4-X5(I)，其中，X1为无或信号肽序列；X2为LaA肽；L1为无或连接肽序列；X3为跨膜结构域；X4为共刺激元件；X5为胞浆信号传导序列CD3ζ；“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。在另一优选例中，X3为CD28的跨膜结构域。在另一优选例中，X4选自下组：共刺激元件4-1BB、共刺激元件CD28、或其组合。在另一优选例中，X3和X4共同由含跨膜结构域的CD28和4-1BB构成。在另一优选例中，L1为Fc元件。在另一优选例中，所述Fc元件为哺乳动物免疫球蛋白的Fc元件，优选为人的免疫球蛋白的Fc元件。在另一优选例中，所述Fc元件为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc元件，优选地，Fc元件为IgG的Fc元件，更优选地，Fc元件为IgG1或IgG2的Fc元件。在另一优选例中，所述Fc元件的长度为200-250个氨基酸，较佳地220-240个氨基酸，更佳地约230个氨基酸。在另一优选例中，所述Fc元件具有如SEQIDNO.:1中第130-359位所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述Fc元件的氨基酸序列如SEQIDNO.:1中第130-359位所示。在另一优选例中，所述多肽元件X1选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X2选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件L1选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X3选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X4选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第428-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X3和X4共同由SEQIDNO.:1中第360-469位所示的氨基酸序列构成。在另一优选例中，所述多肽元件X3和X4共同具有与SEQIDNO.:1中第360-469位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的氨基酸序列。在另一优选例中，所述多肽元件X3和X4共同为将SEQIDNO.:1中第360-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽。在另一优选例中，所述多肽元件X5选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第470-581位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。在另一优选例中，所述融合蛋白具有如SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述融合蛋白为重组蛋白。在另一优选例中，所述融合蛋白能与LaA-BCR蛋白特异性结合。在另一优选例中，所述融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所述结构：X1‑X2‑L1‑X3‑X4‑X5   (I)，其中，X1为无或信号肽序列；X2为LaA肽；L1为无或连接肽序列；X3为跨膜结构域；X4为共刺激元件；X5为胞浆信号传导序列CD3ζ；“‑”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所述结构：X1-X2-L1-X3-X4-X5(I)，其中，X1为无或信号肽序列；X2为LaA肽；L1为无或连接肽序列；X3为跨膜结构域；X4为共刺激元件；X5为胞浆信号传导序列CD3ζ；“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽元件X1选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第1-22位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或所述多肽元件X2选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第23-129位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或所述多肽元件L1选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第130-359位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或所述多肽元件X3选自下组：(A)具有SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列的多肽；(B)具有与SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；(C)将SEQIDNO.:1中第360-427位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林，金泽明，孟会敏，
申请(专利权)人：博生吉医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32