因子X变体制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质，其是包含SEQ ID No.:1的突变序列的因子X变体，所述蛋白质在其N‑末端包含序列SEQ ID No.：7的信号肽和不同于因子X的天然前肽的前肽。

Factor X variant

The present invention relates to a protein, which is a factor X variant containing a mutation sequence of SEQ ID No. 1. The protein contains a signal peptide of SEQ ID No. 7 and a natural propeptide different from factor X at its N end.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】因子X变体
本专利技术涉及因子X变体，及其用于治疗凝血障碍的用途。
技术介绍
因子X是血液中存在的蛋白质。该蛋白质在凝血级联中起重要作用。血液凝固是一个复杂的过程，其可以防止血液经受损的血管流出。一旦血管破裂，负责凝血的成分彼此相互作用以在血管破裂的位置处形成血栓，即血小板血栓。需要凝血因子将血小板栓子保持在适当位置并稳定凝块。正常凝块的形成分四步进行：步骤1血管受损。步骤2血管收缩以限制向受损区域提供血液。步骤3血小板粘附于血管损伤期间暴露的内皮下空间以及也粘附于受刺激的血管壁。血小板散布，这被称为“血小板粘附”。这些散布的血小板释放激活其他相邻血小板的物质，使得其在损伤部位聚集以形成血小板血栓。这被称为“血小板聚集”。步骤4激活的血小板表面由此构成可以发生血液凝固的表面。在血液中循环的凝血蛋白(包括因子X)在血小板表面被激活并形成纤维蛋白凝块。这些凝血蛋白(即因子I、II、V、VIII、IX、X、XI、XII和XIII以及vonWillebrand因子)在链反应即凝血级联中起作用。因子X的激活形式(Xa)更具体地涉及将凝血酶原(因子II)激活为凝血酶(因子IIa)，特别是当其与激活的辅因子V复合以形成凝血酶原酶复合物时。该因子是凝血级联中的必需成分。当缺乏这种因子时，会出现出血，如鼻衄(鼻出血)、关节血肿(血液渗入关节腔)或胃肠道出血。因子X缺陷极为罕见。它是常染色体隐性传播的，患病率为1/1000000。Fx激活发生在：-由凝血因子VIIa/组织因子复合物引发凝血级联起始步骤的非常早期，在相对低效的反应中导致形成痕量的凝血酶；或者-在由痕量凝血酶引起的正反馈所导致的凝血级联放大步骤中，其导致因子VIII和IX的激活。后两种因子在患有血友病A和B的个体中缺失，因此导致如果不进行治疗可能致命的出血性疾病。缺乏这些因子意味着不可能产生足够量的激活因子X来终止出血。因子X轻链的前42个氨基酸(SEQIDNo.：5的残基1-42)代表“Gla”结构域，其是磷脂结合结构域。“Gla”结构域含有11个谷氨酸(Glu)残基，其全部或部分被翻译后修饰(γ-羧化)，得到γ-羧基谷氨酸(Gla)。因此因子X是凝血蛋白，其生物活性取决于其“Gla”结构域的γ-羧化程度。所有“Gla”蛋白或Gla结构域蛋白都依赖于维生素K。维生素K是一种脂溶性维生素，其参与谷氨酸蛋白残基的γ-羧化以形成γ-羧基谷氨酸残基。γ-羧基谷氨酸残基对于具有Gla结构域的所有蛋白质的生物活性是必需的，特别是通过高钙离子结合亲和力。因此证明维生素K依赖性蛋白质中γ-羧化Glu残基(也称为Gla残基)的存在对于其功能激活是必需的。因此，因子X上Glu残基的存在及其γ-羧化水平对于激活的因子X的功能活性是必需的。因此，需要一种可被凝血酶激活的修饰因子X，其具有一定程度的γ-羧化，使得可以在不存在因子VIII和/或因子IX的情况下通过直接使用凝血起始期间产生的痕量凝血酶来实现有效的凝血。
技术实现思路
本专利技术人已经鉴定了特定因子X突变体(也称为因子X变体)，其可以被凝血酶有效激活，由此使得可以在不存在因子VIII和因子IX的情况下恢复凝血。优选地，本专利技术人鉴定的这些特定因子X突变体也可以在不存在因子X的情况下恢复凝血。实际上，如实施例中所证明的，这些因子X突变体可以被凝血酶激活，并且即使在没有内源性因子VIII和/或因子IX和/或因子X的情况下也允许有效地凝血。这些因子X突变体有利地表现出高度的γ-羧化。术语“高度的γ-羧化”意指γ-羧化程度至少等于血浆因子X的γ-羧化程度的20％，优选至少等于血浆因子X的γ-羧化程度的25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，其中所述血浆因子X的γ-羧化程度被视为100％。本专利技术涉及蛋白质，其是包含SEQIDNo.：1的突变序列的因子X变体，所述蛋白质包含，在其N-末端，由序列SEQIDNo.：7所示的因子X的天然信号肽、和不同于因子X的天然前肽的前肽。本专利技术涉及包含SEQIDNo.：1的突变序列的蛋白质，所述SEQIDNo.：1的突变序列包含突变A、A'、B、C或C'，其中：突变A为：序列SEQIDNo.：1的氨基酸43至52被选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列取代，突变A'为：序列SEQIDNo.：1的氨基酸47至52被选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列取代，突变B为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列，突变C为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列，以及缺失序列SEQIDNo.：1的氨基酸4至13，突变C'为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列，以及缺失序列SEQIDNo.：1的氨基酸4至9，其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺，和所述蛋白质在其N-末端包含与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽。优选地，本专利技术涉及包含SEQIDNo.:1的突变序列的蛋白质，所述SEQIDNo.：1的突变序列包含突变，所述突变为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列(即上述突变B)，其中N*任选是糖基化的天冬酰胺，和所述蛋白质在其N-末端包含与不同于因子X的凝血因子的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽。根据本专利技术的这种蛋白质是突变的因子X，其有效治疗凝血障碍。特别地，编码根据本专利技术的突变因子X并从N-末端到C-末端包含如下序列组合的序列：-不同于因子X的天然前肽的前肽，-序列SEQIDNo.：7的信号肽，-根据本专利技术的SEQIDNo.：1的突变序列，可以直接影响表达的因子X的γ-羧化，其中与包含根据本专利技术的SEQIDNo.:1的突变序列、但在其N-末端不包含与不同于因子X的凝血因子的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽的因子X相比，该γ-羧化增加。优选地，该因子X突变体表现出的γ-羧化程度，至少等于血浆因子X的γ-羧化程度的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，其中所述血浆因子X的γ-羧化程度被视为100％。本专利技术的另一个主题是编码所述蛋白质的多核苷酸。本专利技术的另一个主题是包含所述多核苷酸的表达载体。本专利技术的另一个主题是包含所述表达载体或所述多核苷酸的宿主细胞。本专利技术的另一个主题是所述蛋白质作为药物的用途。特别地，所述蛋白质可用于治疗凝血障碍，特别是出血性疾患，如血友病A、B和C(因子XI缺陷)、或因子X缺陷、或甚至替代因子VIIa用于紧急凝血需要。当需要强有力且快速的促凝血反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，其是包含SEQ ID No.:1的突变序列的因子X变体，其特征在于所述SEQ ID No.:1的突变序列包含突变A、A'、B、C或C'，其中：突变A为：序列SEQ ID No.：1的氨基酸43至52被选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列取代，突变A'为：序列SEQ ID No.：1的氨基酸47至52被选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列取代，突变B为：在序列SEQ ID No.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列，突变C为：在序列SEQ ID No.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列，以及缺失序列SEQ ID No.：1的氨基酸4至13，突变C'为：在序列SEQ ID No.：1的氨基酸52和53之间插入选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列，以及缺失序列SEQ ID No.：1的氨基酸4至9，其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺，且所述蛋白质在其N‑末端包含与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQ ID No.：7的信号肽。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.06 FR 16540981.一种蛋白质，其是包含SEQIDNo.:1的突变序列的因子X变体，其特征在于所述SEQIDNo.:1的突变序列包含突变A、A'、B、C或C'，其中：突变A为：序列SEQIDNo.：1的氨基酸43至52被选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列取代，突变A'为：序列SEQIDNo.：1的氨基酸47至52被选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列取代，突变B为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR、KATXATLSPR、TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列，突变C为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自DFLAEGLTPR、KATN*ATLSPR和KATXATLSPR的序列，以及缺失序列SEQIDNo.：1的氨基酸4至13，突变C'为：在序列SEQIDNo.：1的氨基酸52和53之间插入选自TSKLTR、FNDFTR、LSSMTR、PPSLTR和LSCGQR的序列，以及缺失序列SEQIDNo.：1的氨基酸4至9，其中N*是任选地糖基化的天冬酰胺，且所述蛋白质在其N-末端包含与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽。2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于SEQIDNo.：1的突变序列包含突变B。3.如权利要求1和2中任一项所述的蛋白质，其特征在于，不同于因子X的天然前肽的前肽选自凝血酶前肽、因子VII前肽和蛋白C前肽、及其修饰形式。4.如权利要求1至3之一所述的蛋白质，其特征在于，前肽选自序列SEQIDNo.：13、SEQIDNo.：14、SEQIDNo.：15和SEQIDNo.：16。5.如权利要求1至4之一所述的蛋白质，其特征在于，与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽选自：序列SEQIDNo.：18、SEQIDNo.：19、SEQIDNo.：20和SEQIDNo.：21。6.如权利要求1至5之一所述的蛋白质，其特征在于，其包含在与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽和SEQIDNo.：1的突变序列之间的中间序列。7.如权利要求6所述的蛋白质，其特征在于中间序列是因子X轻链的序列，优选序列SEQIDNo.：5。8.如权利要求1至7之一所述的蛋白质，其特征在于其从N-末端至C-末端包含：-与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽，然后是-序列SEQIDNo.：5，然后是-SEQIDNo.：1的突变序列。9.如权利要求1至8之一所述的蛋白质，其特征在于其从N-末端至C-末端包含：-与不同于因子X的天然前肽的前肽融合的序列SEQIDNo.：7的信号肽，然后是-序列SEQIDNo.：5，然后是-序列SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·S·什图鲁，JL·普兰迪尔，T·阿巴彻，
申请(专利权)人：法国血液分割暨生化制品实验室，
类型：发明
国别省市：法国,FR