一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶技术

本发明专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶。本发明专利技术提供一株微小毛霉菌株具体为微小毛霉(Mueor pusillus)GHM356，保藏编号为CGMCC No.14136。本发明专利技术还公开了利用该菌株生产凝乳酶的工业生产方法，用该菌株经种子培养和液体深层发酵可使发酵液酶活达到272000U/mL以上，经提取制得的凝乳酶产品，成品低廉，凝乳酶酶活力较高，蛋白酶活力低，稳定性好、专一性强，其最适反应温度明显低于其他来源的凝乳酶，在适合乳酸菌生长的温度条件下可以保持较高的酶活性，热稳定性较差，在较低的温度条件下就可以除去乳清中残存的凝乳酶，有利于乳清的再次利用，比其他来源的凝乳酶更加适用于干酪的生产行业。

A method for high-yield chymosin and its chymosin production

The invention belongs to the field of bioengineering, in particular to a method for producing high chymosin and chymosin produced by the method. The present invention provides a strain of Mueor pusillus GHM356 with a storage number of CGMCC No. 14136. The invention also discloses an industrial production method of chymosin by using the strain. The enzyme activity of fermentation broth can reach 272 000 U/mL by seed culture and submerged liquid fermentation. The chymosin product obtained by extraction has low cost, high chymosin activity, low protease activity, good stability and specificity, and its optimal reaction temperature is lower than that of coagulation from other sources. Lactase can maintain high enzyme activity at suitable temperature for the growth of lactic acid bacteria, and has poor thermal stability. It can remove the remaining chymosin in whey at lower temperature, which is conducive to the reuse of whey. It is more suitable for cheese production than chymosin from other sources.

【技术实现步骤摘要】
一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶
：本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶。
技术介绍
：凝乳酶是干酪制作过程中起凝乳作用的关键性酶，是一种最早在未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成为干酪生产中形成质构和特殊风味的关键性酶，被广泛地应用于奶酪和酸奶的制作。传统生产主要是利用牛犊第四胃的皱胃酶提取制作凝乳酶，近来凝乳酶的来源不断扩大，目前包括三类：动物性凝乳酶，来源于牛胃、猪胃和羊胃；植物性凝乳酶，来源于无花果树液和菠萝果实；微生物凝乳酶，来源于霉菌和酵母菌。由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为凝乳酶的主要来源。凝乳酶是奶酪生产中首要的催化剂，并且高的凝乳酶活性(MCA)会伴随着较低的蛋白酶活性，这样，会使得奶酪生产更高效，高质。但是，微生物生产的凝乳酶存在蛋白水解能力高，特异性不强等缺点。我们需要利用一些生物技术，对菌种进行优化选育和改良，提高产品产量和质量。近年来国内外多位学者对凝乳酶的作用机理、酶学性质、酶固定化、基因克隆表达等方面做了大量工作取得了明显进展。近几年随着我国液体乳的快速发展，越来越多的企业及科研单位开始重视奶酪的开发，奶酪的制作工艺在国内已经广为传之。然而，奶酪的味道并不能为大部分人所接受，这是制约奶酪在国内市场发展的重要因素之一。因此从各个方面了解奶酪的成熟机理，改善优化奶酪的口味，使之为我国人民所接受有着重要的意义。与此同时，我们知道发酵食品的风味与微生物有着不可分割的关系，所以微生物在奶酪发酵成熟的作用是现在也应该是未来我们所关注的一个方向。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种高产凝乳酶的方法及其所产凝乳酶。本实验室经物理诱变和化学复合诱变后得到一株凝乳酶高产突变菌株GHM356，经鉴定其属于微小毛霉(Mucorpusillus)，该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14136。该菌株是由微小毛霉H23经常温常压等离子体诱变和亚硝基胍复合诱变选育获得。微小毛霉H23摇瓶凝乳酶发酵最高酶活为3500U/mL，发酵过程中孢子量多，菌丝结球，发酵液较为粘稠不利于传质。该菌株经诱变后孢子产量减少，菌丝不宜结球，摇瓶最高凝乳酶活为26530U/mL。该突变株在工业放大生产时，通过补料条件优化使微小毛霉突变菌株GHM356的发酵酶活达到272000U/mL以上。除此之外，该突变菌株的蛋白酶活力显著降低，因此，使得该突变菌株产生的酶稳定性较好、专一性强，用其制备的奶酪的口感和品质较好。本专利技术所述微小毛霉突变株GHM356液体发酵技术主要包括如下步骤：培养条件与方法：发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量7％的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH5.5、37℃、300-800rpm，当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％；发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；发酵周期为120h左右；进一步地，种子罐培养方法如下：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量5％的比例接入种子罐培养基，在初始pH5.5、37℃、转速300-800rpm条件下培养36h；所述凝乳酶的提取与精制方法如下：按发酵液体积加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；用超滤膜对澄清压滤酶液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂8％葡萄糖、氯化钠10％，防腐剂0.15％山梨酸钾，然后用硅藻土进行过滤除菌，即得到凝乳酶成品酶制剂。所述凝乳酶的酶学性质如下：温度：最适反应温度为35℃；35℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性，当温度升至40℃时，酶活随着保温时间的延长酶活下降为75％左右，45℃时其热稳定性明显减弱。pH：最适pH为4.0；在pH1.0-8.0的条件下24h后，相对酶活力仍然保持在75％以上。有益效果：1、本专利技术首先提供了一株高产凝乳酶的微小毛霉突变菌株，利用该菌株进行工业化发酵生产的发酵酶活水平可达到272000U/mL以上，大大降低了生产成本，有利于凝乳酶的大规模应用，节能减排。2、该突变菌株所产的凝乳酶特征是最适反应温度为35℃，在40℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性；最适反应pH为3.5，在pH3.0-7.0的条件下24h后，相对酶活力仍然保持在85％以上，可以广泛的应用于奶酪制作行业。3、诱变菌株GHM356的MCA/PA为31.0，是出发菌株的10.6倍，可见诱变菌株GHM356所产凝乳酶具有较好的特异性。附图说明：图1本专利技术凝乳酶最适反应温度曲线；图2本专利技术凝乳酶热稳定性曲线；图3本专利技术凝乳酶最适反应pH曲线；图4本专利技术凝乳酶pH稳定性曲线。具体实施方式：以下通过具体实施例对本专利技术做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本专利技术实施范围的限定。本专利技术实施例所用培养基如下(如未特别说明，“％”指质量体积百分比)：1)斜面培养基配制如下：麦芽汁40培养基，琼脂1.5％，121℃灭菌20min，备用。2)筛选平板培养基配制如下：蔗糖30g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，淀粉10g，脱脂奶粉20g，琼脂20g，水1000mL；调pH6.0，121℃灭菌20min，备用；3)种子培养基配方：葡萄糖4％、酵母粉2.5％、NaNO30.4％、KCl0.15％；pH自然。4)摇瓶发酵培养基配方为：小麦淀粉3.6％，酵母粉3.2％，蛋白胨2.5％，葡萄糖2.8％，麸皮2.5％，CMC1.6％，KH2PO40.15％，CaCl20.005％，调pH6.0，121℃灭菌20min；5)种子罐培养基配方为：葡萄糖2％，酵母膏1％，糊精5％，大豆分离蛋白1.3％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸铵0.1％，玉米浆1.5％，pH5.5，121-123℃灭菌30-40min；6)发酵罐培养基配方为：小麦淀粉2.3％，大豆分离蛋白3.5％，黄豆粉3.2％，甘油3.2％，磷酸二氢钾2.1％，硫酸镁0.2％，其余为水，pH5.5，121-123℃灭菌30-40min；7)补料培养基配方为：玉米淀粉25％，豆饼粉5.2％，玉米浆2.3％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.2％，其余为水，pH5.5。实施例1菌株的诱变选育1)原生质体的制备取一株出发菌株微小毛霉H23的新鲜培养斜面，用无菌生理盐水洗脱菌体，转移至装有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床振荡30min使菌体分散，用无菌脱脂棉过滤，收集单孢子，用生理盐水调整单孢子浓度为106个/ml左右，将孢子悬液接种到菌丝液体生长培养基中。收集长至对数生长期的菌丝体，用0.6M山梨醇渗透压稳定剂(0.1M柠檬酸缓冲+0.6M山梨醇+0.01MEDTA)悬浮，离心洗涤后收集菌丝体，用渗透压稳定剂悬浮，置冰中备用。然后加入溶壁酶1％、蜗牛酶1％、纤维素酶2％、溶菌酶0.5％，在37℃条件下进行酶解1.5-2h，期间随时取样镜检原生质体的制备情况，选择合适的酶解时间，制得原生质体备用，其中原生质体制备率和再生率的计算方法如下：在普通培养基培养并计菌落数为A；将原生质体悬浮液稀释一定倍数，在普通培养基培养并计菌落数为B；在高渗再生培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用微小毛霉菌株发酵生产凝乳酶的方法，其特征在于，具体如下：发酵罐培养：将种子液按照接种量7％的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH 5.5、37℃、300‑800rpm，当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％‑30％；发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；发酵周期为120h左右；所述菌株具体为微小毛霉(Mucor pusillus)GHM356，保藏编号为CGMCC No.14136。

【技术特征摘要】
1.一种采用微小毛霉菌株发酵生产凝乳酶的方法，其特征在于，具体如下：发酵罐培养：将种子液按照接种量7％的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH5.5、37℃、300-800rpm，当溶氧降至最低再升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％；发酵至菌体自溶严重，酶活无明显提高时放罐；发酵周期为120h左右；所述菌株具体为微小毛霉(Mucorpusillus)GHM356，保藏编号为CGMCCNo.14136。2.如权利要求1所述的发酵生产凝乳酶的方法，其特征在于，发酵罐培养基质量体积百分比组成为：小麦淀粉2.3％，大豆分离蛋白3.5％，黄豆粉3.2％，甘油3.2％，磷酸二氢钾2.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王克芬，刘文龙，王兴吉，钱娟娟，郭庆文，贾仁洁，
申请(专利权)人：山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37