一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。本发明专利技术通过基因工程的手段，改造了PRRSV GP5‑M基因，通过构建杆状病毒表达载体制备得到具有高免疫原性的PRRSV病毒样颗粒。另外，本发明专利技术通过免疫佐剂的改进，得到了一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，该亚单位疫苗具有更好的免疫效果。

An Immune Enhanced Recombinant PRRSV Viroid Granule Subunit Vaccine

The invention discloses an immune-enhanced recombinant PRRSV virus-like particle subunit vaccine, which is composed of PRRSV virus-like particle and compound immune adjuvant. By means of genetic engineering, the PRRSV GP5 M gene is modified, and PRRSV virus-like particles with high immunogenicity are prepared by constructing baculovirus expression vector. In addition, by improving the immune adjuvant, the invention obtains an immune-enhanced recombinant PRRSV virus-like particle subunit vaccine, which has better immune effect.

【技术实现步骤摘要】
一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗
本专利技术属于兽用生物
，具体涉及一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSvirus，PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，因其临床上常常造成耳部发绀，又称蓝耳病，，主要引起母猪早产、流产、产死胎或木乃伊胎，仔猪和育成猪出现呼吸道疾病，发病率与死亡率高｡该病最初于20世纪80年代在美国被首先报道，1996年起在我国发现首例临床病毒分离报道，2005年底出现高致病性PRRSV的大面积爆发。PRRSV是呈单股正链的RNA病毒，属于动脉炎病毒科，根据抗原性和基因序列的不同，将全球的PRRSV分为以VR-2332为代表的美洲型(NorthAmerican，NA)和以Lelystadvirus(LV)为代表的欧洲型(European，EU)。我国流行的PRRSV主要是经典美洲株和变异型美洲株，但近几年欧洲株也屡有发现。此外，PRRSV变异性和重组能力强，不时有新分支出现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。

【技术特征摘要】
1.一种免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，由PRRSV病毒样颗粒和复合免疫佐剂组成。2.根据权利要求1所述的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：将重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M按5-10%比例接种健康sf9细胞，27℃培养4-5天后，反复冻融收集细胞及上清，于4℃条件下12000r/min离心20分钟后收集上清，然后使用硫酸铵沉淀法将目的蛋白沉淀，重悬后使用二乙烯亚胺（BEI）对蛋白溶液进行36-48小时灭活，之后使用等量硫代硫酸钠中和，采用0.9%的生理盐水调整至蛋白含量为100μg/mL，最后与复合免疫佐剂混合乳化配制疫苗，置于2-8℃备用。3.根据权利要求2所述的免疫增强型重组PRRSV病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的制备方法包括如下步骤：步骤一，表达PRRSVGP5与M蛋白的重组杆状病毒的构建，通过下述步骤制备获得：（1）PRRSV的免疫原性基因GP5与M的串联基因GP5M的人工修饰合成：比对分析2006-2016年间PRRSV流行毒株的基因序列，根据田间流行优势毒株氨基酸特征与密码子的偏嗜性，并根据免疫原性的需要，对其进行了基因改造后，人工合成GP5-M基因序列，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示；（2）杆状病毒转移载体的构建：以pBAC5质粒为骨架，通过XbaI与BamHI酶切载体与插入片段，然后通过T4连接酶于16℃过夜连接，转化筛选阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定，获得杆状病毒转移载体pBAC-PRRSVGP5-M；步骤二，重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的构建：（1）重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M的获得与鉴定：取测序鉴定正确的杆状病毒转移载体pBAC-PRRSVGP5-M质粒DNA与DH10Bac感受态细胞混合，冰浴30分钟后，于42℃进行45秒水浴热激，然后冰浴5分钟，加入SOC液体培养基，37℃振荡培养2小时，按10倍系列稀释之后，各梯度菌液涂布LB平板，使用life公司的筛选试剂盒筛选纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M；（2）重组杆状病毒Ac-PRRSVGP5-M的获得：将上一步提取的重组杆粒rBac-PRRSVGP5-M，使用脂质体转染试剂Lipofectamine3000，转染至sf9细胞中，在28℃持续培养观察，于转染后24小时、48小时与72小时利用荧光显微镜观察重组杆状病毒绿色荧光信号，并于转染后72小时收集细胞上清，得到重组杆状病毒，然后将其再次接种健康sf9细胞扩大培养，收集病毒液作为毒种置于-70℃保存备用。4.根据权利要求1所述的免疫增强型重组PRRSV...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞，杜恩岐，董剑辉，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61