流加发酵设备制造技术

本发明专利技术提供了发酵罐在发酵氨基酸（尤其是流加发酵L‑赖氨酸）的方法中的应用，其中，第二发酵罐包括罐体、能封闭罐体的罐盖和旋转轴以及从上到下设置的旋转盘和旋转杆。

Fed-batch fermentation equipment

The invention provides the application of a fermentation tank in the method of fermenting amino acids (especially L lysine) by fed-batch fermentation. The second fermentation tank comprises a tank body, a lid and a rotating shaft capable of closing the tank body, and a rotating disc and a rotating rod arranged from top to bottom.

【技术实现步骤摘要】
流加发酵设备
本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及流加发酵L-赖氨酸的方法及其中所用的设备，如发酵罐等。
技术介绍
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。中国专利CN102234666A公开了一种流加发酵L-赖氨酸的方法，其中利用了酶活性提高的吡啶核苷酸转氢酶。然而令人意外的是，本专利技术人经过长期艰苦研究，偶然地筛选出了新的吡啶核苷酸转氢酶突变体，其能进一步提高相应的酶活性并在相同条件下进一步提高赖氨酸的发酵量。尽管该突变体在微生物（尤其是棒状杆菌）中表达会带来对消泡剂的一定敏感性，但是结合本专利技术人未公开使用的发酵罐，可以避免消泡剂的使用，所以完全能够利用其优点，而避免其缺点的影响。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的流加发酵L-赖氨酸的方法，其包括将包括将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，然后向第二发酵罐持续流加糖，之后再向第二发酵罐持续流加糖和氮源,其中吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列的第37位为Met。另外，本专利技术还提供了所述方法生产中所用的设备，如发酵罐等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了持续流加发酵L-赖氨酸的方法，其包括：（1）将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于31-38℃培养10-20小时，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体由吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体组成，其中吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列的第37位为Met；（2）将步骤（1）获得的培养液以3-7%（体积）的接种量接种于第二发酵罐，于36-40℃培养3-8小时；（3）向第二发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0.35%（重量），进行10-18小时；和（4）向第二发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0.5%（重量），而且氮源的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.1-0.25%（重量），进行30-65小时，优选50-55小时。在本文中，“第一”和“第二”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，即第一发酵罐和第二发酵罐是不同的，但是不对发酵罐本身结构进行限定。在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液（接入的菌液）体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。优选在本专利技术第一方面的方法中，第一发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，KH2PO430-80公斤，MgSO4·7H2O3-15公斤，FeSO4·7H2O0.1-1公斤，MnSO4·7H2O0.1-1公斤，生物素5-30克，和叶酸3-10克。在本专利技术的具体实施方式中，第一发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，KH2PO445公斤，MgSO4·7H2O7公斤，FeSO4·7H2O0.5公斤，MnSO4·7H2O0.5公斤，生物素12克，和叶酸5克。优选在本专利技术第一方面的方法中，第二发酵罐的培养基配方为：每315立方米培养基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米浆10000-15000公斤，KH2PO4700-1200公斤，MgSO4·7H2O5-220公斤，FeSO4·7H2O5-25公斤，MnSO4·7H2O5-220公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。在本专利技术的具体实施方式中，第二发酵罐的培养基配方为：每315立方米培养基中含，葡萄糖12000公斤，甘蔗糖蜜1000公斤，玉米浆12000公斤，KH2PO41000公斤，MgSO4·7H2O100公斤，FeSO4·7H2O12，MnSO4·7H2O120公斤，生物素200克，和叶酸85克。步骤（3）和（4）的部分培养条件（如，温度，pH等）与步骤（2）的可以相同也可以不同。优选步骤（3）和（4）中的温度与步骤（2）中的温度相同，即均为36-40℃，优选均为38-39℃。步骤（2）中，不进行流加操作；而在步骤（3）和（4）中，pH维持在6.5至7.8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质（如，培养液）的重量的百分比量。优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤（3）和（4）中的糖是葡萄糖。在步骤（3）中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0.35%（重量），优选为0.27-0.33%（重量）。在步骤（4）中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0.5%（重量），优选为0.42-0.48%（重量）。优选在本专利技术第一方面的方法中，步骤（4）中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵，如硫酸铵。在步骤（4）中，硫酸铵的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.1-0.25%（重量），优选为0.17-0.23%（重量）。在本专利技术中，野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白和基因登录号NP416120.1和AAC74674.1所示。另外，中国专利CN102234666A公开了一种酶活性提高的吡啶核苷酸转氢酶优选本专利技术第一方面的方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体，即编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的多核苷酸的上游。在本专利技术的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。其中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列的第37位为Met，即发生了37M突变，优选其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。另外，在本专利技术的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本专利技术第一方面的方法中，工程菌是棒状杆菌。由于棒状杆菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入棒状杆菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.发酵罐在发酵氨基酸（如，L‑赖氨酸）的方法中的应用，其中，发酵罐包括罐体（1）、能封闭罐体（1）的罐盖（2）和旋转轴（31），其中，罐盖（2）上带有加料管（4），用于向罐体（1）内加入流体；加料管（4）带有阀门（41）；罐体（1）内由上自下依次包括漏斗（5）、旋转盘（6）和旋转杆（7），其中旋转盘（6）水平设置于罐体（1）的上部，旋转杆（7）水平设置于罐体（1）的中部；漏斗（5）的上部能承接从加料管（4）加入的流体，下部开口对准旋转盘（6）的上表面的开口并深入旋转盘（6）的内腔至旋转盘（6）上下表面间的中部（优选是一半高度处）；旋转盘（6）的内腔中沿旋转盘（6）的侧表面环形设置筛网（62），筛网（62）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的上部（优选是4/5高度处）；旋转盘（6）的内腔的筛网（62）内设置有多根扰流柱（61），每根扰流柱（61）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的中部或上部（优选是2/3高度处）；旋转盘（6）的侧表面均匀设置多个孔，每个孔连接一根旋转盘（6）的侧表面外设置的离心排液管（63）（优选离心排液管（63）是柔性伸缩的），用于将旋转盘（6）的内腔内的流体排出（优选从离心排液管（63）的开口向下的开口（631）处排出）；旋转杆（7）上均匀垂直设置有多根栅（71）；旋转轴（31）从罐盖（2）上通入罐体（1）内并与旋转盘（6）的下表面中心点和旋转杆（7）的中心点固定，从而旋转轴（31）旋转时带动旋转盘（6）和旋转杆（7）旋转。...

【技术特征摘要】
1.发酵罐在发酵氨基酸（如，L-赖氨酸）的方法中的应用，其中，发酵罐包括罐体（1）、能封闭罐体（1）的罐盖（2）和旋转轴（31），其中，罐盖（2）上带有加料管（4），用于向罐体（1）内加入流体；加料管（4）带有阀门（41）；罐体（1）内由上自下依次包括漏斗（5）、旋转盘（6）和旋转杆（7），其中旋转盘（6）水平设置于罐体（1）的上部，旋转杆（7）水平设置于罐体（1）的中部；漏斗（5）的上部能承接从加料管（4）加入的流体，下部开口对准旋转盘（6）的上表面的开口并深入旋转盘（6）的内腔至旋转盘（6）上下表面间的中部（优选是一半高度处）；旋转盘（6）的内腔中沿旋转盘（6）的侧表面环形设置筛网（62），筛网（62）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的上部（优选是4/5高度处）；旋转盘（6）的内腔的筛网（62）内设置有多根扰流柱（61），每根扰流柱（61）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的中部或上部（优选是2/3高度处）；旋转盘（6）的侧表面均匀设置多个孔，每个孔连接一根旋转盘（6）的侧表面外设置的离心排液管（63）（优选离心排液管（63）是柔性伸缩的），用于将旋转盘（6）的内腔内的流体排出（优选从离心排液管（63）的开口向下的开口（631）处排出）；旋转杆（7）上均匀垂直设置有多根栅（71）；旋转轴（31）从罐盖（2）上通入罐体（1）内并与旋转盘（6）的下表面中心点和旋转杆（7）的中心点固定，从而旋转轴（31）旋转时带动旋转盘（6）和旋转杆（7）旋转。2.权利要求1所述的应用，其中罐体（1）底面呈倒锥形，锥形顶点设置有孔，该孔连接有带有阀门（111）的排料管（11）。3.权利要求1所述的应用，其中多根扰流柱（61）呈十字形围绕旋转盘（6）的下表面中心点分布；和/或，扰流柱（61）的高度低于筛网（62）的高度。4.权利要求1所述的应用，其中罐体（1）内的培养液的液面处于旋转盘（6）和旋转杆（7）之间。5.权利要求1所述的应用，其中发酵氨基酸（如，L-赖氨酸）的方法是流加发酵L-赖氨酸的方法。6.权利要求5所述的应用，其中流加发酵L-赖氨酸的方法包括：（1）将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于31-38℃培养10-20小时，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体由吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体组成，其中吡啶核苷酸转氢酶α亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勇，孟刚，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64