本发明专利技术公开了一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述亮氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术运用基因工程手段以pET‑28a为表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，并通过进一步筛选获得亮氨酸脱氢酶，该酶具有酶活较高，底物耐受性较好，热稳定性较高的特性，在工业生产中能够有效延长半衰期，达到降低生产成本的目的。
A Leucine Dehydrogenase Based on Database Gene Mining Method
The invention discloses a leucine dehydrogenase obtained by database gene mining method. The amino acid sequence of the leucine dehydrogenase is SEQ ID NO.1, and the nucleotide sequence of the leucine dehydrogenase gene is SEQ ID NO.2. The leucine dehydrogenase is expressed heterologously in Escherichia coli BL21 (DE3) using pET 28a as expression vector by genetic engineering method, and obtained through further screening. The leucine dehydrogenase has the characteristics of high enzyme activity, good substrate tolerance and high thermal stability, and can effectively prolong half-life in industrial production and achieve the purpose of reducing production cost.
【技术实现步骤摘要】
一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶
本专利技术涉及基因工程和微生物
，尤其是涉及一种采用数据库基因挖掘的方法制备亮氨酸脱氢酶的过程。
技术介绍
手性氨基酸是一类具有重要价值的医药中间体，在生物体内参与氧化、还原、水解及C-C键的形成，具有不同的生理功能，因此很多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)的开发均使用了人工合成的手性氨基酸，在所有的手性氨基酸中，L-叔亮氨酸由于其叔丁基侧链的空间位阻大，且具有高度的疏水性，因此以其合成的手性药物在体内具有良好的生物稳定性，广泛应用于抗肿瘤抑制剂如治疗癌症、风湿性关节炎及抗HIV蛋白酶抑制剂的手性合成。亮氨酸脱氢酶(LeucineDehydrogenase，LeuDH，EC1.4.1.9)是一种以NADH以及其氧化态为辅酶因子的氧化还原酶。该酶可催化L-亮氨酸及其他支链L型氨基酸的氧化，同时也能够可逆地将一些酮酸还原成对应的L型氨基酸。该酶最先由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中筛选而来，后来逐渐被发现存在于杆菌属、芽孢八叠球菌属、棒状杆菌属以及高温放线菌属等。基于蛋白一级结构与蛋白表达的功能之间并没有绝对的对应关系，序列一致性高不代表催化性能也相似，若是关键的催化位点发生突变，则催化性质就会大不相同。所以我们可以利用基因挖掘的便利性，找到酶活较高，底物耐受性较好，热稳定性较好的亮氨酸脱氢酶，并对其用于制备L-叔亮氨酸进行研究，优化反应条件并放大制备体系，为进行工业化生产及应用做好准备。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶。本专利技术亮氨酸脱氢酶具有酶活较高，底物耐受性较好，热稳定性较高的特性，在工业生产中能够有效延长半衰期，达到降低生产成本的目的。本专利技术的技术方案如下：一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1。一种编码所述亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.2。一种含有所述亮氨酸脱氢酶基因的表达载体。一种含有所述表达载体的重组菌，所述重组菌由表达载体转化宿主细胞制得。一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，制备方法为：(1)构建重组菌，将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET-28a(+)上，得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET-28a(+)-LeuDH，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-LeuDH；(2)培养重组菌，将重组菌接种于50mL灭菌后的LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下过夜培养，按照1％的接种量将种子培养液接于含有50μg·mL-1卡那霉素的50mL的LB液体培养基中培养至OD600为0.4～0.6时，加入终浓度为0.3mM的IPTG25℃诱导15h；(3)收集亮氨酸脱氢酶，培养后的重组大肠杆菌细胞冷冻离心，并用生理盐水清洗两次，用测定酶活力的缓冲液充分悬浮细胞，超声波破碎细胞，破壁后的菌体12000rpm冷冻离心10min，收集上清液，得到亮氨酸脱氢酶酶液。步骤(3)中所述离心条件为8800rpm的转速下离心10min；所述缓冲液为1M的NH4Cl-NH3·H2O缓冲液，其pH值为8.5；所述超声条件为200W，超声1s，间歇2s，共10min。本专利技术通过数据库基因挖掘技术筛选获得亮氨酸脱氢酶基因，以具有较高亮氨酸脱氢酶活力的氨基酸序列为模板，在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，根据设定的筛选标准，获得目的基因，根据基因序列设计引物通过PCR技术扩增获得编码基因序列，电泳鉴定后回收纯化PCR产物并克隆至pMD18-T载体构建重组质粒，将重组质粒转化至E.coliJM109，挑取多个阳性转化子至LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12h～16h，提取质粒后进行双酶切和PCR验证。将验证正确的重组质粒和表达载体经同样的限制酶双酶切后进行连接，连接产物转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，经诱导培养实现亮氨酸脱氢酶的高效表达。(1)数据库基因挖掘技术筛选亮氨酸脱氢酶基因根据已报道的亮氨酸脱氢酶外源表达文献，选择具有较高亮氨酸脱氢酶活力的氨基酸序列为模板，在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，根据设定的筛选标准获得一系列与已知氨基酸同源性不同的亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列和其编码的核苷酸序列。(2)PCR扩增亮氨酸脱氢酶基因以经合成的核苷酸序列设计引物(P1、P2)，通过PCR扩增亮氨酸脱氢酶基因。PCR扩增反应在20μL体系中进行，反应体系中加入10μL2xEsTaqMasterMix，8μL的ddH2O，0.4μL的模板DNA，上下游引物各0.8μL。反应条件为在94℃预变性5min后开始循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行电泳鉴定后回收纯化并克隆至pMD18-T载体构建重组质粒，将重组质粒转化至E.coliJM109，挑取多个阳性转化子至LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12h～16h，提取质粒后进行双酶切验证，将验证正确的进行序列测定。(3)重组表达质粒的构建本研究以pET-28a(+)为例开展重组表达质粒的构建，将表达质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用相同的两个限制酶进行双酶切，37℃酶切4h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过连接，连接产物转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性(50mg·mL-1)的LB固体培养基中培养10h～12h，挑取阳性克隆子至含卡那霉素(50mg·mL-1)的LB液体培养基中培养，在37℃，180rpm条件下培养12h～16h后提取质粒并命名为pET-28a(+)-LeuDH。(4)重组表达菌株的构建与筛选本研究以大肠杆菌为例，将重组质粒pET-28a(+)-LeuDH经42℃热击90s转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性(50mg·mL-1)的LB固体培养基中培养10h～12h，挑取阳性克隆子至含卡那霉素(50mg·mL-1)的LB液体培养基中培养过夜，次日按1％接种量接种于含卡那霉素(50mg·mL-1)的50mL新鲜的LB液体培养基中培养约2h至OD600为0.5-0.6时加入0.3mM的IPTG进行诱导，诱导条件为25℃，180rpm，15h。培养后的重组大肠杆菌细胞冷冻离心(8800rpm，10min)，并用生理盐水清洗两次，用测定酶活力的缓冲液充分悬浮细胞(1MNH4Cl-NH3·H2O，pH值8.5)，超声波破碎细胞(200W，超声1s，间歇2s，共10min)，破壁后的菌体12000rpm冷冻离心10min，获得上清粗酶液。(5)重组亮氨酸脱氢酶的SDS-PAGE分析根据蛋白胶试剂盒的说明制备分离胶与浓缩胶，取100μL上述获得的上清粗酶液然后加入25μL5xloadingbuffer，充分混匀后与沸水浴中放置10min使蛋白变性。然后进行上样并加入Marker。上层浓缩胶用80V电压，当样品移动本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1。2.一种编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2。3.一种含有权利要求2所述亮氨酸脱氢酶基因的表达载体。4.一种含有权利要求3所述表达载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌由表达载体转化宿主细胞制得。5.根据权利要求1所的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶的制备方法为：(1)构建重组菌，将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET-28a(+)上，得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET-28a(+)-LeuDH，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-LeuDH；(2)培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗玮，朱静，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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