新型天冬氨酸脱氢酶及在天冬氨酸族氨基酸生产上的应用制造技术

本发明专利技术涉及天冬氨酸脱氢酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：99，100，101或102所示。

New aspartate dehydrogenase and its application in the production of aspartate amino acids

The present invention relates to aspartate dehydrogenase, which is characterized by amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99, 100, 101 or 102.

【技术实现步骤摘要】
新型天冬氨酸脱氢酶及在天冬氨酸族氨基酸生产上的应用
本专利技术涉及一种新型天冬氨酸脱氢酶，以及其在生产天冬氨酸族氨基酸中的应用。
技术介绍
天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸，苏氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸以及β-丙氨酸。天冬氨酸组氨基酸是重要的前体原料，在食品添加剂、化妆品、医药领域有广泛的应用，因此具有重要的商业价值。微生物转化法，包括酶催化和微生物发酵，是目前生产天冬氨酸族氨基酸的主要方法。在天冬氨酸族氨基酸的生物转化过程中，天冬氨酸是生理代谢的关键节点。目前已知自然界存在三条合成天冬氨酸的催化反应：一、由天冬氨酸酶催化，以富马酸与铵根为底物合成天冬氨酸；二、由天冬氨酸转氨酶催化，以谷氨酸和草酰乙酸为底物反应生成天冬氨酸和2-酮戊二酸，这实质是一个以谷氨酸为氨基供体的转氨反应；三、由天冬氨酸脱氢酶(Aspartatedehydrogenase，AspDH)催化的、以游离铵根为氨基供体的加氨反应。目前，以天冬氨酸为前体的氨基酸发酵过程，主要是好氧发酵。在这个过程中，从草酰乙酸生成天冬氨酸，主要依靠天冬氨酸转氨酶的催化实现。好氧发酵会导致高耗能和碳的损失，因此厌氧发酵生产氨基酸从成本上更具有吸引力。但在厌氧过程中，由于TCA途径活力很弱，不能够为草酰乙酸的胺化提供足够的氨基供体-谷氨酸，因此可以预见在厌氧发酵中由转氨酶介导的胺化反应效率将显著降低。与之对比，天冬氨酸脱氢酶可直接以铵根离子为氨基供体，而不依赖谷氨酸的供给，因此在厌氧发酵过程中将具有重要的应用潜力。与天冬氨酸酶和天冬氨酸转氨酶相比，天冬氨酸脱氢酶发现的较晚。首次关于天冬氨酸脱氢酶的报道是在2003年，Yang等人[1]在一种极端嗜热菌海栖热袍菌Thermotogamaritima中发现编号为TM1643的ORF具备天冬氨酸脱氢酶活性，但是其氨基酸序列与其他氨基酸脱氢酶序列并没有显著同源性。2006年，Yoneda[2]据海栖热袍菌天冬氨酸脱氢酶序列，发现来源于古菌Archaeoglobusfulgidus的天冬氨酸脱氢酶，并对其结构[2]和酶学性质做了进一步的研究。虽然以上两种天冬氨酸脱氢酶都有很好的热稳定性，但是它们在常温下表现出来的酶活力都很低，限制了天冬氨酸脱氢酶的应用价值。2011年Li先后对来源于Pseudomonasaeruginosa[3](在下文缩写为Pae)和Ralstoniaeutropha[4](在下文中缩写为Reu)的天冬氨酸脱氢酶进行了研究。与之前嗜热型天冬氨酸脱氢酶不同，这两种天冬氨酸脱氢酶最适反应温度都在37℃，比酶活达到127和137U/mg。2013年，来源于Rhodopseudomonaspalustris和Bradyrhizobiumjaponicum两种NADPH依赖型的天冬氨酸脱氢酶也被报道[5]。目前为止，只有以上六种天冬氨酸脱氢酶被报道。目前天冬氨酸脱氢酶在实际应用中存在的主要问题是：1.胺化活力较低。经实际测试，Pseudomonasaeruginosa和Ralstoniaeutropha来源的天冬氨酸脱氢酶比活力低于1U/mg；2.最适pH偏碱性，在中性条件下酶活很低。由于细菌胞内pH通常在7.3～7.7范围内，因此这限制了该酶在大肠杆菌等模式菌株中的应用。3.蛋白不稳定，纯化后的蛋白很容易聚集，这可能导致表达出的有效酶活很低。本专利通过对基因数据库的深入挖掘，筛选到了催化效率高、在中性条件下仍能保持较高活力，且稳定性好的新天冬氨酸脱氢酶，并在天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸的生物转化过程中显示出了良好的效果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一些天冬氨酸脱氢酶。本专利技术的第二个目的在于提供一种利用所述天冬氨酸脱氢酶在其他微生物异源表达生产天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸的方法。为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案逐一实现：一种天冬氨酸脱氢酶(AspDH)，催化草酰乙酸与铵根以及NAD(P)H反应生成天冬氨酸与水以及NAD(P)+的可逆反应，由以下微生物中的一种或几种产生：克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)、变形斑沙雷氏菌(Serratiaproteamaculans)、需盐色盐杆菌(Chromohalobactersalexigens)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、戴尔福特菌Csl-4(Delftiasp.Csl-4)、人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)、柄杆菌(Caulobactersp.)、马氏甲烷嗜盐菌(Methanohalophilusmahii)、柴氏海洋玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、嗜酸产甲烷菌(Methanosphaerulapalustris)、瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacterruminantium)、Roseibacteriumelongatum。所述天冬氨酸脱氢酶基因序列分别如SEQIDNO：2-SEQIDNO：13所示。所述的天冬氨酸脱氢酶基因可以通过PCR由所述微生物扩增得到，也可以通过全基因合成，可根据宿主密码子偏好性进行密码子优化。本专利技术还保护一种利用上述天冬氨酸脱氢酶生产天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸的生物转化方法。由表达克雷伯氏肺炎菌、变形斑沙雷氏菌、需盐色盐杆菌、鲍氏不动杆菌、戴尔福特菌Csl-4、人苍白杆菌、柄杆菌、马氏甲烷嗜盐菌、柴氏海洋玫瑰杆菌、嗜酸产甲烷菌和瘤胃甲烷短杆菌来源的天冬氨酸脱氢酶的基因工程菌作为催化剂进行生物转化合成天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸。其中上述菌株来源的AspDH基因可采用常规的基因工程手段获得，如以上述菌株染色体DNA为模板通过PCR获得或根据其序列合成。采用合成方法时，可根据不同的表达系统对密码子的偏好，将编码这些AspDH基因中部分或者全部对宿主而言稀有的密码子替换为宿主偏好密码子。所述AspDH基因可以通过在宿主细胞内独立复制的表达载体引入宿主细胞，也可以通过如同源重组等方法整合到受体染色体上。通常所用于进行基因表达的宿主菌都可以作为表达AspDH的受体菌，包括细菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、芽孢杆菌等；酵母菌，如酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母，多型汉逊酵母等；霉菌，包括米曲霉、黑曲霉等；光合细菌，包括聚球藻、集胞藻等。AspDH基因的表达可以采用通用的高效诱导型启动子，组成型启动子，也可以采用宿主自身的启动子。过量表达AspDH基因的重组菌可以采用常规方法发酵培养，可以是好氧发酵培养，也可以是厌氧发酵培养。培养基底物可以是葡萄糖、甘油、木糖、甲醇或者CO2。也可以通过直接催化的方式，添加的底物可以是乳酸、丙酮酸、草酰乙酸、富马酸等。具体地，本专利技术的一个方面涉及天冬氨酸脱氢酶，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO：99，100，101或102所示。在本专利技术的一个实施方案中，所述天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO：99，100，101或102所示的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同源性，并且分别来源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)，戴尔福特菌Cs1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.天冬氨酸脱氢酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：99，100，101或102所示。

【技术特征摘要】
1.天冬氨酸脱氢酶，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO：99，100，101或102所示。2.权利要求1所述的天冬氨酸脱氢酶，其特征在于，所述天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列与SEQIDNO：99，100，101或102所示的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同源性，并且分别来源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)，戴尔福特菌Cs1-4(Delftiasp.Cs1-4)，变形斑沙雷氏菌(Serratiaproteamaculans)或人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)。3.编码权利要求1或2的天冬氨酸脱氢酶的核苷酸序列。4.权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱泰承，李浩，苗良田，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11