一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及干细胞技术领域，更具体地，涉及一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法。该复合外泌体为内部包载有mir‑181b的脐带间充质干细胞外泌体，其制备方法包括如下步骤：(1)人脐带间充质干细胞的培养；(2)人脐带间充质干细胞外泌体提取、纯化；(3)合成mir‑181b；(4)电穿孔mir‑181b包载于步骤(2)中纯化的脐带间充质干细胞外泌体获取复合外泌体样品；(5)复合外泌体样品进行膜修复；(6)复合外泌体的抽取与纯化。该方法将具有促进人血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成功能的mir‑181b包载于人脐带间充质干细胞外泌体内形成复合外泌体，使形成的复合外泌体的治疗针对性更强，该方法简单易行，包载成功率高。

A compound exosome of umbilical cord mesenchymal stem cells and its preparation method

The invention relates to the technical field of stem cells, more specifically to a umbilical cord mesenchymal stem cell compound exosome and a preparation method thereof. The compound exosome is an exosome of umbilical cord mesenchymal stem cells containing Mir 181b. Its preparation method includes the following steps: (1) culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells; (2) extraction and purification of human umbilical cord mesenchymal stem cells exosome; (3) synthesis of Mir 181b; (4) electroporation of Mir 181b encapsulated in step (2) acquisition of compound exosome from purified umbilical cord mesenchymal stem cells exosome. Samples; (5) composite exosome samples for membrane repair; (6) extraction and purification of composite exosomes. Mir 181b, which can promote the proliferation, migration and angiogenesis of human vascular endothelial cells, is encapsulated in the exosome of human umbilical cord mesenchymal stem cells to form complex exosomes, which makes the treatment of the formed complex exosomes more targeted. This method is simple and feasible, and the encapsulation success rate is high.

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法
本专利技术涉及干细胞
，更具体地，涉及一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法。
技术介绍
脐带间充质干细胞分离于新生儿出生后的废弃组织-脐带。因其来源广泛，易获取、无伦理性争议、免疫原性低、对供者无伤害等优势，现已成为最具有转化应用前景的间充质干细胞。脐带间充质干细胞可用于治疗糖尿病足，中枢神经损伤，风湿性关节炎，红斑狼疮等疾病。间充质干细胞具有的多种生物学功能在临床上得到了广泛的关注，其治疗机制成为近年干细胞领域相关研究的热点。外泌体被认为是间充质干细胞发挥旁分泌作用的载体，通过将分子包裹在膜内，外泌体可以保护酶或者RNA免于降解，并通过细胞内吞作用来促进细胞内摄取。此外，外泌体是一种纳米大小的颗粒，易于在血液以及其他体液中转移。目前大量研究表明，间充质干细胞来源的外泌体可以通过其内容的蛋白、RNA成分胞间转移，发挥与间充质干细胞相类似的组织修复、免疫抑制、调节免疫功能等作用。然而与间充质干细胞相比，间充质干细胞外泌体还具有以下优势：1、间充质干细胞外泌体没有细胞的活性，并且不存在形成肿瘤的风险。此外，由于膜结合蛋白含量较低，外泌体的免疫原性低于间充质干细胞。2、间充质干细胞外泌体对维持细胞内稳态以及对外界刺激作出反应起到了重要的作用。当组织微环境稳态因疾病或损伤而遭到破坏时，这种作用就显得更加重要了。3、间充质干细胞外泌体富含生物活性分子，如蛋白质和RNA。存在于外泌体中的许多蛋白质都属于酶类，具有催化活性，并且这些活性与所处的环境有关，如底物浓度和pH。因而，若用于治疗，外泌体中的酶也许可以缓解药物剂量不足或过量的问题。除此之外，间充质干细胞来源的外泌体性质更稳定，保存运输方便，因此间充质干细胞外泌体有望成为一种新的皮肤修复治疗策略。然而现有脐带间充质干细胞外泌体在修复皮肤真皮层时效果不佳，在疾病治疗领域的针对性不强。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法，该方法将具有促进人血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成功能的mir-181b包载于人脐带间充质干细胞外泌体内形成复合外泌体，使形成的复合外泌体的治疗针对性更强，该方法简单易行，包载成功率高。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的在于提出一种脐带间充质干细胞复合外泌体，所述复合外泌体为内部包载有mir-181b的脐带间充质干细胞外泌体。本专利技术的第二个目的在于提出一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，该制备方法用于制备上述的复合外泌体，包括如下步骤：(1)人脐带间充质干细胞的培养；(2)人脐带间充质干细胞外泌体提取、纯化；(3)合成mir-181b；(4)电穿孔mir-181b包载于步骤(1)中纯化的脐带间充质干细胞外泌体获取复合外泌体样品；(5)复合外泌体样品进行膜修复；(6)复合外泌体的抽取、纯化与保存。进一步地，所述步骤(1)人脐带间充质干细胞的培养，具体操作是：取生长良好的人脐带间充质干细胞，用DMEM/F12培养液进行细胞计数，达到106/ml后原代培养，按5×106cells/ml接种到T75细胞培养瓶，置于CO2体积浓度为5％的37℃培养箱中培养，细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×104cells/ml传代扩增，取P2～P5代的人脐带间充质干细胞；P2～P5代的人脐带间充质干细胞置于O2体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养，直到细胞达70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12h，将无血清的饥饿培养液换为含有10ng/ml表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液。进一步地，所述步骤(4)的方法为：向1ml含50mM海藻糖的磷酸缓冲盐溶液中分别加入步骤(2)纯化的脐带间充质干细胞外泌体和步骤(3)合成的mir-181b，均匀混合形成混合反应液，混合反应液加入穿孔皿中进行电穿孔；所述混合反应液包括脐带间充质干细胞外泌体100μg～300ug、mir-181b5～20μl。更进一步地，所述步骤(4)中电穿孔的穿孔条件为：电压100V、电容125μF、放电时间1ms、放电次数为1次。进一步地，所述步骤(6)的方法为：复合外泌体样品经10万～14万g(RCF)离心力超速离心两次，每次70～90min，弃尽上清，沉淀物即为同时负载mir-181b的复合外泌体，复合外泌体-80℃保存备用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术将mir-181b包载于人脐带间充质干细胞外泌体，充分结合了人脐带间充质干细胞外泌体具有的组织修复功能和mir-181具有的促进人血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成功能，通过电穿将mir-181包载于人脐带间充质干细胞外泌体内，该复合外泌体的治疗针对性更强。该方法简单易行，包载成功率高该方法简单易行，成功率高。(2)脐带间充质干细胞取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，极其适合于临床研究和应用。(3)本专利技术制备的复合外泌体在发挥治疗的作用的基础上，为临床应用研究提供可靠的实验研究数据及理论基础。附图说明图1为实施例1中穿孔前的脐带间充质干细胞外泌体的电镜照片。图2为实施例1中穿孔后的脐带间充质干细胞外泌体的电镜照片。图3为实施例3中WesternBlotCD81、CD63鉴定复合外泌体蛋白。具体实施方式展示一下实例来具体说明本专利技术的某些实施例，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。本专利技术所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：复合外泌体的制备一、人脐带间充质干细胞外泌体的制备配制DMEM/F12培养液，培养液含质量浓度20％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将脐带用75％乙醇浸泡4min，PBS浸泡清洗3次，剔除血管后剪成1cm2小块，浸没于质量浓度0.1％的Ⅱ型胶原酶，37℃消化50分钟，加入0.25％胰酶，37℃消化10分钟，加入血清终止胰酶消化，将前述细胞组织液过滤，离心，弃去上层清液，取下层细胞。将下层细胞加DMEM/F12培养液进行细胞计数，达到106/ml后原代培养，按5×106cells/ml接种到T75细胞培养瓶，每个细胞培养瓶中DMEM/F12培养液体积为20ml，置于CO2体积比浓度5％的37℃培养箱中培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每4d半量换液1次，10d时细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×104cells/ml传代扩增，取P2～P5代的人脐带间充质干细胞。P2代的人脐带间充质干细胞置于O2体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养，直到细胞达70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12h，将无血清的饥饿培养液换为含有1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐带间充质干细胞复合外泌体，其特征在于，所述复合外泌体为内部包载有mir‑181b的脐带间充质干细胞外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞复合外泌体，其特征在于，所述复合外泌体为内部包载有mir-181b的脐带间充质干细胞外泌体。2.一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，该制备方法用于制备权利要求1所述的复合外泌体，包括如下步骤：(1)人脐带间充质干细胞的培养；(2)人脐带间充质干细胞外泌体提取、纯化；(3)合成mir-181b；(4)电穿孔mir-181b包载于步骤(2)中纯化的脐带间充质干细胞外泌体，获取复合外泌体样品；(5)复合外泌体样品进行膜修复；(6)复合外泌体的抽取、纯化与保存。3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)人脐带间充质干细胞的培养，具体操作是：取生长良好的人脐带间充质干细胞，用DMEM/F12培养液进行细胞计数，达到106/ml后原代培养，按5×106cells/ml接种到T75细胞培养瓶，置于CO2体积浓度为5％的37℃培养箱中培养，细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×104cells/ml传代扩增，取P2～P5代的人脐带间充质干细胞；P2～P5代的人脐带间充质干细胞置于O2体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用DM...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜大奎，戴琳，
申请(专利权)人：姜大奎，
类型：发明
国别省市：辽宁,21