有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用技术

有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用。本发明专利技术提供了一种诱导型多能干细胞。该诱导型多能干细胞的HBA2基因不具有westmead突变。根据本发明专利技术实施例的诱导型多能干细胞最初是由由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，依据一定的基因修复手段对初始诱导型多能干细胞进行突变修复后，获得本申请的诱导型多能干细胞，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不再具有westmead突变。根据本发明专利技术实施例的诱导型多能干细胞具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。

Effective Repair of Westmead Mutation in Thalassemia and Its Application

The method and application of effective repair of Westmead mutation in thalassemia. The present invention provides an induced pluripotent stem cell. The HBA2 gene of the induced pluripotent stem cells did not have Westmead mutation. The induced pluripotent stem cells according to an embodiment of the present invention are initially induced by human amniotic fluid cells carrying the Westmead mutation of thalassemia. After the initial induced pluripotent stem cells are mutantly repaired by a certain gene repair method, the induced pluripotent stem cells are obtained. The HBA2 gene of the induced pluripotent stem cells no longer has the Westmead mutation. The induced pluripotent stem cells according to an embodiment of the present invention have pluripotency, and the hematopoietic function of the induced pluripotent stem cells is significantly improved compared with the induced pluripotent stem cells with a Westmead mutation.

【技术实现步骤摘要】
有效修复地中海贫血Westmead突变的方法及应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体地，本专利技术涉及诱导型多能干细胞及其制备方法和用途。
技术介绍
地中海贫血波及了全球，占世界人口的2％，约2.5亿人口为地贫的携带者，其包括α及β地贫，多分布于地中海、非洲等沿海地域，而中国常见于广东、海南等南部沿海区域。成人血红蛋白由4条相互平衡的珠蛋白链构成，包括2条α链和2条β链。ll号常染色体上指导血红蛋白中的β珠蛋白合成的β珠蛋白基因(HBBgene)缺陷引起β珠蛋白合成困难或减少，α珠蛋白失去平衡，多余的α珠蛋白沉积于红细胞膜上，从而破坏红细胞膜，引起溶血性贫血，该常染色体遗传病因而称为β地中海贫血。β-地中海贫血一共有300多种突变类型，与镰刀形细胞性贫血一起时对于城市的发展是有极大的影响的。而位于16号染色体上的α珠蛋白基因(α-glonbingene，HBA)缺陷可引起α链的合成不足，β链相对过多，对于胎儿来说形成γ4四聚物，称为HbBart's，患病胎儿则称为巴氏水肿胎儿。而对于成人来说形成β4四聚物，称为HbH，相应疾病则称为HbH病。αβ复合地中海贫血则其HBA和HBB都发生了突变，α珠蛋白和β珠蛋白有可能相对平衡，但在临床中发现轻型复合型地贫的临床症状常常主要以轻型的β地贫的症状出现，α地贫的症状被掩盖；而重型复合型地贫常常表现出中间型地贫的症状，关于海南地区的地贫研究发现αβ复合地贫的发生率达到了32.16％，若αβ复合地贫携带者跟正常人生育，最多表现为轻型地贫的症状，但若跟轻型α地贫或β地贫患者婚配，则生出重型患者的几率达到了25％，若跟同样是携带αβ复合突变的患者结婚，那么生出重型地贫患者的几率会大大增高。中间型地贫患者的临床症状有很大的差异，可轻可重,轻型患者仅表现为轻度贫血，而重型患者则类似于重型β地贫患者的临床表现，但与之不同的是中间型患儿可至6、7岁都不需要输血或者只需要偶尔输血便能维持生活，但此后症状逐渐加重，需要长期的输血治疗。重型地贫若不给予输血或其他治疗，患儿诞生不久就会夭折。输血治疗虽然可以暂时缓解贫血症状，不过长期反复地输血，铁离子就会不断地沉积在体内，最后寿命将终止于器官衰竭。当前可以根治地贫仅有的方法是异基因骨髓或造血干细胞移植、自身或异体脐带血移植。但是移植物抗宿主病及免疫排斥依然是异体移植必须面临着的两个难题，因此就需要找到主要组织相容性抗原相匹配的供体，以避免上述排斥反应的发生，对于移植3年以上的患者仍然存在着一些免疫并发症以及移植失败的风险，在缺乏供体的情况下，可以在移植自体骨髓前将突变位点纠正后再行移植，这或许是治疗地贫的新希望，或者将正常的HBB、HBA导入患者靶细胞弥补缺失的功能也是目前地中海贫血最直接的治疗方式，但由于缺乏安全有效的表达载体而进展缓慢。因此，安全有效地治疗地中海贫血地方法还有待进一步开发。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种诱导型多能干细胞。根据本专利技术的实施例，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不具有westmead突变，所述诱导型多能干细胞最初来源于地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞并经过IPS诱导和突变修复而来。根据本专利技术实施例的诱导型多能干细胞最初是由由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，依据一定的基因修复手段对初始诱导型多能干细胞进行突变修复后，获得本申请的诱导型型多能干细胞，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不再具有westmead突变。根据本专利技术实施例的诱导型多能干细胞具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。根据本专利技术的实施例，上述诱导型多能干细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因具有SEQIDNO:3示的核苷酸序列。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种制备前面所示诱导型多能干细胞的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：对初始诱导型多能干细胞进行突变修复，以便获得所述诱导型多能干细胞，所述初始诱导型多能干细胞由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，所述突变为HBA2基因的westmead突变。根据本专利技术实施例的方法获得诱导型多能干细胞的HBA2基因不再具有westmead突变，所述诱导型多能干细胞具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述突变修复是通过CRISPR/Cas9技术实现的。CRISPR/Cas9相对于ZFN、TALEN更加简单，且在时间上可以实现准确调控，甚至在干细胞分化的各个阶段进行特定基因的编辑。根据本专利技术的实施例，所述HBA2基因的westmead突变的修复是通过如下方式进行的：1)构建sgRNA，所述sgRNA是针对HBA2基因的第三个外显子下游200bp位置设计的，所述sgRNA具有SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列；2)将所述sgRNA插入PX330，以便构建质粒HBA2-sgRNA；将所述sgRNA插入pTP53-GFP-reporter载体，以便构建质粒HBA2-GFP-reporter-sgRNA；3)通过钙转方式将所述质粒GFP-reporter-sgRNA和质粒HBB-sgRNA转染入293T细胞，以检测sgRNA的活性；4)构建质粒HBA2-Donor，所述HBA2-Donor的左臂包括完整HBA2基因；5)将线性化的所述质粒HBA2-Donor以及质粒HBA2-sgRNA电转入iPS细胞株；6)将步骤5)获得的iPS细胞株经过G418的筛选、PCR+克隆以及测序分析，以便获得westmead突变修复的iPS细胞株。根据本专利技术实施例的上述方法可有效实现westmead突变修复，效率高达14％。根据本专利技术的实施例，所述携带地中海贫血症westmead突变的羊水细胞为人孕中期羊水细胞，所述羊水细胞为具有westmead突变的ααws/αα的细胞。进而取材方便，其中同时ααws/αα突变细胞表示存在人α珠蛋白基因(HBA2gene)Westmead(CAC→CAG)突变的细胞。在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种有效修复地中海贫血Westmead(CAC→CAG)突变的方法。所述方法包括：对初始诱导型多能干细胞进行突变修复，所述初始诱导型多能干细胞由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，所述突变为HBA2基因的westmead(CAC→CAG)突变，根据本专利技术的实施例构建质粒HBA2-sgRNA、HBA2-Donor，通过电转染的方式将上述质粒转入含ααws/αα突变的iPSCs，对其westmead突变位点进行修复得到完整修复的iPS细胞株αα/αα_correctediPS。根据本专利技术实施例的方法获得诱导型多能干细胞αα/αα_correctediPS具有多能性，相对于具有westmead突变的诱导型多能干细胞在造血功能方面明显地提高。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了前面所述的诱导型多能干细胞(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导型多能干细胞，其特征在于，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不具有westmead突变，所述诱导型多能干细胞最初来源于地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞并经过IPS诱导和突变修复而来。

【技术特征摘要】
1.一种诱导型多能干细胞，其特征在于，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因不具有westmead突变，所述诱导型多能干细胞最初来源于地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞并经过IPS诱导和突变修复而来。2.根据权利要求1所述的诱导型多能干细胞，其特征在于，所述诱导型多能干细胞的HBA2基因具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。3.一种制备权利要求1或2所述诱导型多能干细胞的方法，其特征在于，包括：对初始诱导型多能干细胞进行突变修复，以便获得所述诱导型多能干细胞，所述初始诱导型多能干细胞由携带地中海贫血症westmead突变的人羊水细胞诱导而来，所述突变为HBA2基因的westmead突变。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述突变修复是通过CRISPR/Cas9技术实现的。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述HBA2基因的westmead突变的修复是通过如下方式进行的：1)构建sgRNA，所述sgRNA是针对HBA2基因的第三个外显子下游200bp位置设计的，所述sgRNA具有SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列；2)将所述sgRNA插入PX330，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马燕琳，龙平，李崎，黄元华，李玲丽，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：海南,46