一种RFF1细胞制造技术

本发明专利技术公开提供了一种RFF1细胞，属于生物技术领域。本发明专利技术公开提供一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，是一种攻防兼顾的超级T细胞，精准性高、杀伤率高。该细胞由以下方法制备得到：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激该FF细胞以筛选精准多肽；敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子；以所述精准多肽负载PBMC并与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合后共培，在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击，得到RFF1细胞。该细胞可用于细胞免疫治疗技术。

A RFF1 cell

The invention discloses an RFF1 cell, which belongs to the field of biotechnology. The invention discloses a RFF1 cell for cell immunotherapy, which is a super T cell with both attack and defense, high precision and high killing rate. The cells were prepared by following methods: PBMC cells were loaded with mutagenic polypeptides, and then impacted on PBMC cells loaded with polypeptides; FF cells were obtained by expanded culture after impact; so that the mutant polypeptides were directly stimulated as antigens to screen precise polypeptides; immunosuppressive signal molecules on PBMC cells were knocked out; and PBM cells were loaded with the precise polypeptides. C was co-cultured with PBMC cells which knocked out immunosuppressive signaling molecules. During co-culture, RFF1 cells were obtained by multiple impacts of precise polypeptides. The cells can be used in cellular immunotherapy.

【技术实现步骤摘要】
一种RFF1细胞
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞及其制备方法。
技术介绍
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以治疗肿瘤。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。生物工程改造过的人体细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，联合多肽冲击及体外共培，将普通T细胞改造为攻防兼备的超级T细胞，解决了免疫细胞在细胞免疫治疗中攻防不能兼顾的问题，精准性好、杀伤率高。本专利技术提供一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其中所述RFF1细胞的制备方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；S5)以筛选的精准多肽负载PBMC细胞，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；S7)冲击后继续培养，得到RFF1细胞。进一步地，步骤S2包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。进一步地，步骤S5中，负载多肽后的PBMC细胞与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞以1:1～1:20的比例混合。进一步地，步骤S6中，在共培过程中，重复多肽冲击3～4次。进一步地，在步骤S6中，每隔3～4天进行一次多肽冲击。进一步地，步骤S6中，在共培过程中用精准多肽进行多肽冲击包括：将负载突变多肽的PBMC与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC混合后在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击；转移至含有培养液OKM100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养，每隔3～4天分别用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击。进一步地，步骤S7中，所述冲击后继续培养以得到RFF1细胞包括：多肽冲击后在含有培养液OKM200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养，以得到RFF1细胞。进一步地，利用CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子。进一步地，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：1)外显子测序对肿瘤细胞进行全外显子测序；将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；2)抗原表位预测以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，得到一段21个氨基酸的多肽，以此作为潜在抗原表位；IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；3)合成多肽采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。进一步地，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，所述工程细胞系包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，是一种攻防兼备的超级T细胞。通过筛选出有效的精准多肽并将其对PBMC细胞进行二次多肽冲击，得到更有特异杀伤作用的T细胞，杀伤效率更高。现有技术中，一般是通过DC细胞递呈T细胞，产生特异杀伤的T细胞；或者用病毒作为载体，通过慢病毒转染技术诱导T细胞的特异性杀伤。在本申请中，通过二次多肽冲击技术诱导T细胞的特异性杀伤。首先第一次多肽冲击，用混合多肽直接刺激PBMC细胞；而后以精准多肽直接刺激PBMC，并在共培养过程中，多次以精准多肽刺激。通过多次刺激将普通T细胞改造成为具有更精准的杀伤能力的超级T细胞。相比慢病毒转染，简单方便、安全性高。此外，本申请中联合靶点敲除防护技术和体外共培及体外扩增，提高T细胞对复杂的肿瘤微环境的适应力，覆盖多种瘤种。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1示出了本专利技术实施例所述RFF1细胞的制备方法的流程示意图；图2示出了抗原负载效率检测；图3示出了精准多肽筛选结果；图4示出了流式检测特异性T细胞比例；图5示出了流式检测免疫抑制性信号分子的敲除情况；图6示出了RFF1细胞对肿瘤的杀伤作用；图7示出了RFF1细胞对细胞因子IFN-γ的释放；图8示出了荷瘤小鼠生存曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式。在肿瘤细胞免疫治疗方面，现有的LAK细胞、DC细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞已基本被证明无效。本专利技术实施例提供一种新的T细胞，用于细胞免疫治疗。本专利技术实施例提供一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其中所述RFF1细胞的制备方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；S5)以筛选的精准多肽负载PBMC细胞，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击；S7)冲击后继续培养，得到RFF1细胞。定义“RFF1”细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其特征在于，所述RFF1细胞的制备方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD‑1、Tim‑3、LAG3、CTLA‑4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；S5)以筛选的精准多肽负载PBMC，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；S7)冲击后继续培养，以得到RFF1细胞。

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其特征在于，所述RFF1细胞的制备方法包括以下步骤：S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；S4)敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；S5)以筛选的精准多肽负载PBMC，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；S7)冲击后继续培养，以得到RFF1细胞。2.根据权利要求1所述的用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其特征在于，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，以得到FF细胞包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。3.根据权利要求1所述的用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其特征在于，步骤S5中，负载精准多肽后的PBMC细胞与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞以1:1～1:20的比例混合。4.根据权利要求1所述的用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其特征在于，步骤S6中，在共培过程中，重复多肽冲击3～4次。5.根据权利要求4所述的用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，周子珊，解佳森，王海燕，李营营，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11