本发明专利技术涉及化学生物学领域。具体涉及一类基于脯氨酰羟化酶抑制剂设计的小分子荧光探针(I)，该类探针的结构模块包括：脯氨酰羟化酶结合基团、连接链和荧光报告基团。本发明专利技术还公开了该类探针的其制备方法。本发明专利技术的脯氨酰羟化酶小分子荧光探针可用于脯氨酰羟化酶抑制剂的高通量筛选，指导脯氨酰羟化酶抑制剂的发现及结构优化。以此类结构的探针作为工具分子，可以快速、准确的确证小分子与靶标蛋白的结合情况。
A class of small molecule fluorescent probes for prolyl hydroxylase and their preparation methods
The invention relates to the field of chemical biology. A class of small molecule fluorescent probes (I) based on prolyl hydroxylase inhibitors are specifically involved. The structural modules of these probes include prolyl hydroxylase binding groups, ligand chains and fluorescent reporting groups. The invention also discloses a preparation method of the probe. The small molecule fluorescent probe of prolyl hydroxylase of the invention can be used for high throughput screening of prolyl hydroxylase inhibitors, guiding the discovery and structural optimization of prolyl hydroxylase inhibitors. As a tool molecule, probes with such structures can quickly and accurately confirm the binding of small molecules to target proteins.
【技术实现步骤摘要】
一类脯氨酰羟化酶小分子荧光探针及其制备方法
本专利技术涉及化学生物学领域。具体涉及一类基于脯氨酰羟化酶抑制剂设计的小分子荧光探针，其制备方法，以及在测定化合物对脯氨酰羟化酶的抑制活性中的应用，可用于脯氨酰羟化酶抑制剂的高通量筛选，同时可指导脯氨酰羟化酶抑制剂的发现及结构优化，适应于指导发现治疗贫血症、缺血性疾病和肾损伤等与脯氨酰羟化酶密切相关疾病的小分子药物。
技术介绍
肾性贫血作为慢性肾病患者最常见的并发症之一，严重降低慢性肾病患者的生活质量，还会导致心血管疾病发病率及死亡率升高。肾性贫血的主要诱因是缺氧诱导因子(HIF)表达下降，导致肾脏产生和分泌促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)不足。EPO的表达受缺氧诱导因子(HIF调控)，而脯氨酰羟化酶(ProlylHydroxylase,PHD)又是HIF的关键负调控因子。因此，抑制PHD酶的生理功能，抑制PHD酶对HIF-α的羟基化作用，从而使得HIF-α逃脱被降解的命运，从而可内源性上调EPO等蛋白，有望治疗包括肾性贫血在内的缺血性疾病。近年来，PHD抑制剂是治疗肾性贫血最有前景的手段(MedChemComm2016,7,1271-1284)。近十多年科学家们一直致力于开发一种可以治疗贫血的PHD小分子抑制剂。到目前为止，处于临床III期研究中的PHD抑制剂包括FG-4592(vadadustat)、AKB-6548(vadadustat)和GSK1278863(daprodustat)。体外抑制活性测试方法以及高通量筛选方法对PHD小分子抑制剂的发展至关重要。准确、稳定、可靠的活性测试方法有助于发现结构新颖的先导化合物，指导先导化合物的结构优化以获得活性更优的候选药物分子，为靶向PHD的肾性贫血等缺血性疾病的治疗药物的开发奠定基础。目前已有的PHD活性测定方法主要包含两大类。一类是基于PHD酶催化活性的测试方法。这类方法主要原理是，PHD酶在辅因子Fe2+及2-酮戊二酸(2-OG)条件下，可羟基化HIF肽段底物，生成羟基化的HIF肽段产物，同时消耗辅因子2-OG。因此，通过检测羟基化HIF肽段产物的相对含量，或者通过检测辅因子2-OG相对消耗量，即可知道PHD酶催化反应的进程情况。那么加入化合物后，通过羟基化HIF肽段产物相对含量或辅因子2-OG相对含量的变化，即可知道PHD酶催化反应被抑制的程度，即可得到待测化合物对PHD酶的抑制率。按照对羟基化HIF肽段及2-OG检测手段的不同，又包括AlphaScreen法(JournalofMedicinalChemistry2012,55,2945-2959.)，MALDI-TOF质谱法(JournalofMedicinalChemistry2009,52,2799–2805)以及邻苯二胺法(AnalyticalBiochemistry2005,336,125-131.)。这些方法都是基于PHD酶的催化反应，因此检测得到的抑制率受反应时间影响较大。由于要保证酶的催化活性，需要保证Fe2+在体系中不被氧化，因此往往还需要在测试体系中加入大量的抗氧化剂，而且往往需要使用较大量的酶。此外，AlphaScreen法检测羟基化的HIF肽段，还需要额外加入抗体、beadsdoner及acceptor，整个检测体系非常复杂；MALDI-TOF质谱法需要用昂贵的质谱仪器；邻苯二胺法需要依赖于邻苯二胺与2-OG进一步发生化学反应转变为荧光物质从而检测2-OG的消耗量。这些方法由于影响测试稳定性的因素过多，测试稳定性往往会受到影响，缺乏灵敏性和容易出现假阳性，不太适用于高通量筛选。另一类是基于PHD酶亲和力的测试方法。目前主要包括核磁共振法(JournalofMedicinalChemistry2013,56,547-555)和HIF肽段荧光探针的荧光偏振法(ACSMedicinalChemistryLetters2015,6,1236-1240)。核磁共振法(JournalofMedicinalChemistry2013,56,547-555)，采用13C标记的辅因子2-OG与PHD酶共孵育，辅因子可进入PHD酶催化口袋与之结合。而加入抑制剂分子后，2-OG可被竞争性地挤出PHD酶结合口袋，呈游离状态。在核磁共振下，2-OG与PHD结合状态及游离状态的信号值是不同的，从而可计算获得结合状态与游离状态的比例，进而获得待测化合物对PHD酶的抑制率。然而，该方法需要依赖昂贵的核磁共振仪器，而且在核磁管中检测往往只能单通道进行，操作繁琐耗时长，不适用于高通量筛选。HIF肽段荧光探针的荧光偏振法(ACSMedicinalChemistryLetters2015,6,1236-1240)是我们在2015年开发的方法。其原理是，采用HIF肽段作为与PHD酶结合的亲和力基团，在HIF肽段末端标记上FITC荧光基团，利用荧光偏振技术，当HIF荧光肽段与PHD酶结合时，荧光偏振信号增强，而HIF荧光肽段与PHD酶分离呈游离状态时，荧光偏振信号减弱。因此，当在HIF荧光肽段及PHD酶体系中加入待测化合物后，通过检测荧光偏振信号值即可获得化合物对PHD酶的抑制剂率。该方法测试体系克服了前述方法无法高通量进行的问题，可用于PHD抑制剂的高通量筛选。但是该方法还是存在一些缺陷，比如该体系依赖于2-OG，因为没有2-OG，HIF荧光肽段则与PHD酶的结合力大幅下降；此外，体系中的内源性辅因子Fe2+被替换为了Mn2+，以避免HIF荧光肽段被羟基化丧失对PHD酶的结合力。因此，该测试体系依然较为复杂，而且采用Mn2+并不能真正反映出化合物与内源性含Fe2+的PHD酶的结合情况。如今，运用小分子荧光探针作为辅助工具，多种小分子与生物大分子的作用模式被确定，这些信息对合理药物设计具有十分重要的意义。比如新的药物靶点的发现，或者对一个已知蛋白的功能做新的阐述，这对于分子水平阐明疾病的发生、发展和治疗尤其重要。以小分子荧光探针作为辅助工具，这些靶点可被发展为高效的高通量筛选模型，并在短时间内随机筛选大量的活性化合物，发现活性更高的小分子化合物作为先导物用于进一步的药物研发。
技术实现思路
为了突破目前PHD酶抑制活性测试方法的局限性，采用我们报道的三氮唑吡啶类PHD抑制剂(JournalMedincalChemistry2018,61,5332-5349)作为PHD酶的结合片段，通过进一步引入荧光基团，得到一类基于PHD酶抑制剂设计的小分子荧光探针，基于本专利技术小分子荧光探针建立的活性测定方法，测试体系简单，保留内源性Fe2+，无需加入其它辅因子，受时间、溶剂影响小，可用于脯氨酰羟化酶抑制剂的高通量筛选，同时可指导脯氨酰羟化酶抑制剂的发现及结构优化，适应于指导发现治疗贫血症、缺血性疾病和肾损伤等与脯氨酰羟化酶密切相关疾病的小分子药物。本专利技术的探针分子包括三个功能部位：脯氨酰羟化酶抑制剂A、连接链L和荧光报告基团B，具体结构如下：其中荧光报告基团包括但不仅限于罗丹明衍生物类荧光片段，优选异硫氰酸荧光素(FITC)。本专利技术的L优选4-10个原子长度的连接链，该连接链主链原子选自碳、氮或氧原子，L可连接在X的邻位或间位。X代表卤素原子。优选氯原子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.通式(I)的小分子荧光探针：
【技术特征摘要】
1.通式(I)的小分子荧光探针：其中L代表4～10个原子长度的连接链，该连接链主链原子选自碳、氮或氧原子，L连接在X的邻位或间位；B为荧光报告基团；X代表卤素；n代表1～3。2.权利要求1的小分子荧光探针，其中荧光报告基团B为异硫氰酸荧光素。3.权利要求1的小分子荧光探针，其中L代表4.权利要求1的小分子荧光探针，其中X代表氯原子。5.权利要求1的小分子荧光探针，其中n代表1或2。6.权利要求1的小分子荧光探针的制备方法，当B为异硫氰酸荧光素时,包括：其中X、L、n的定义...
【专利技术属性】
技术研发人员：尤启冬，张晓进，李治红，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。