【技术实现步骤摘要】
一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种酵母双杂交文库构建方法专利申请事宜。
技术介绍
转录因子（transcriptionfactor，TF），也称反式作用因子（trans-actingelement），是一类能够特异性结合真核生物启动子区域中顺式作用元件（cis-actingelement）的蛋白质，其功能是调控基因的开启、关闭及表达量的高低，转录因子的时空表达直接决定了植物的生长发育、逆境反应和次生代谢等生理功能。另一方面，研究发现转录因子间也存在相互作用，能够相互结合形成复合体，直接结合到调控基因的启动子上，共同调控相关基因的转录水平，从而完成复杂的生理过程（ChenD,etal.Antagonisticbasichelix-loop-helix/bZIPtranscriptionfactorsformtranscriptionalmodulesthatintegratelightandreactiveoxygenspeciessignalinginArabidopsis.PlantCell.2013,25(5...
【技术保护点】
1.一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，该方法具体包括下述步骤：（1）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计依据目的作物烟草基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤如下：第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子；第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子；第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集；第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为...
【技术特征摘要】
1.一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，该方法具体包括下述步骤：（1）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计依据目的作物烟草基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤如下：第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子；第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子；第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集；第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为建库用转录因子；最后，基于上述操作，最终获得全长转录因子；（2）制备cDNA模板提取目的作物样品的总RNA，并反转录合成第一链cDNA；（3）PCR扩增利用平末端DNA聚合酶进行PCR扩增，获得全长转录因子的全长开放阅读框；（4）磷酸化处理对步骤（3）的PCR扩增产物进行5'端磷酸化；（5）连接重组接头将步骤（4）中5'端磷酸化后的PCR扩增产物连接重组接头；（6）构建全长转录因子的文库质粒将步骤（5）中连接有重组接头的5'端磷酸化PCR扩增产物与酵母双杂交载体进行重组连接，构建获得全长转录因子的文库质粒；（7）质粒转化并构建文库将步骤（6）中所构建全长转录因子文库质粒转化、筛选，获得全长转录因子酵母双杂交文库。2.如权利要求1所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，步骤（6）中，所述酵母双杂交载体，采用线性化的酵母双杂交载体pGADT7。3.如权利要求1所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物时，设计原则及要求如下：第一，基于全长转录因子CDS序列，对每个转录因子的ORF进行引物设计；第二，引物长度应在18~28bp之间，PCR扩增时，退火温度在55~65℃之间，引物对之间最大退火温差不超过5度，最终产物长度在200~3000bp范围内；第三，为了保证读码框准确，在上游引物5'末端添加1个碱基；具体添加的碱基根据引物含量确定，具体要求为：对于GC含量小于40%的，添加C；GC含量大于50%的添...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗朝鹏，杨军，谢小东，张剑锋，魏攀，李锋，武明珠，王中，李泽锋，曹培健，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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