一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用技术

本发明专利技术公布了一种在酿酒酵母中高效无痕敲除的方法，并通过对该无痕基因敲除系统中的正向同源序列、半乳糖浓度及半乳糖诱导时间进行优化，第二步同源重组的概率达到6.86×10

An Efficient Traceless Gene Knockout Method for Saccharomyces cerevisiae and Its Application

The invention discloses an efficient and traceless knockout method in Saccharomyces cerevisiae, and optimizes the forward homologous sequence, galactose concentration and galactose induction time of the traceless gene knockout system. The probability of the second step of homologous recombination is 6.86*10.

【技术实现步骤摘要】
一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用
：本专利技术涉及基因工程领域，具体是在酿酒酵母中构建一种高效的无痕基因敲除方法并用该方法构建了一株低产高级醇的酿酒酵母菌株。
技术介绍
：酿酒酵母是一种典型的真核细胞模型和重要的模式生物，它的特性包括：生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等，这些特性使酿酒酵母更方便于进行基因工程和遗传学研究，称为真核生物中的“大肠杆菌”。随着分子生物学以及基因工程技术的不断发展和不断更新，酿酒酵母的育种方法已经由最初的自然育种发展为现代的定向基因工程育种。基因敲除(geneknockout)是20世纪80年代末发展起来的一种遗传工程技术，是通过适当的方法使机体特定的基因缺失或失活，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。但是随着公众对食品安全的关注，通过传统遗传学方法构建的菌株，由于残留非本身的外源基因，其生产应用受到限制。因此应用无痕敲除技术敲除机体的特定基因成为目前遗传育种的发展方向。酵母菌的无痕修饰起初是为了除去筛选标记，以便在单个菌株中进行多基因操作。去除筛选标记主要有两种方法，一种是利用重组酶介导的敲除系统，例如Cre/Loxp系统，Cre重组酶能介导两个LoxP位点之间发生特异性重组，把两个位点间的基因删除。通过第一次化学转化，将带有同向两个LoxP位点和筛选标记的片段整合到基因组上；然后通过第二次化学转化导入带有编码Cre重组酶基因的质粒，利用Cre重组酶的表达切除两个位点之间所有序列，从而完成筛选标记的去除。2004年，Iwaki等人将该系统应用于酵母中，实现了对酵母的多基因敲除。Cre/loxP方法具有很高的效率，但是会在染色体上残留一个外源序列(LoxP位点)，当进行多基因敲除时候，残留的LoxP位点增加了染色体重排的可能。另一种方法则是利用敲除元件中正向重复序列(hisG)之间的同源重组，首先需要构建带有“hisG—URA3—hisG”的质粒，然后使用长引物PCR直接得到敲除元件，通过转化敲除目的基因后，再反向筛选，利用正向重复序列(hisG)之间的同源重组去除筛选标记。2012年，Dong等人应用该方法实现了酵母基因的无痕敲除，但是该方法在诱导第二步同源重组的几率是随机的，产生的转化子不只一种，使得最终得到理想转化子的几率变低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。2014年，Bao等首次利用CRISPR-Cas系统对酿酒酵母实现多基因一步敲除。但是该系统中设计的向导RNA(sgRNA)在指导Cas蛋白与基因组进行识别时会与非靶点DNA序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应，严重制约了该技术的广泛应用。总之，本领域仍需要一种高效的无痕基因敲除方法。高级醇是酿酒酵母酒精发酵过程中的重要代谢产物，也是白酒、葡萄酒等酒精饮料中主要的风味物质，其含量的多少及各种醇之间的比例对酒的风味有着重要的影响，适量的高级醇和协调的组分比可以赋予酒特殊的香味，同时衬托出酯的香气，使酒的口感协调、柔和。而高级醇含量过高会使酒产生异杂味，影响酒的风味和品质，并且高级醇在人体内的氧化速度比乙醇慢，其对人体的毒害作用远远高于乙醇。因此，控制高级醇含量是现代酿造过程中一项重要的指标。在酿酒酵母酒精发酵过程中，有两条高级醇代谢途径，分别为糖代谢合成途径(Harris途径)和氨基酸分解代谢途径(Ehrlich途径)。在氨基酸分解代谢途径中，酿酒酵母支链氨基酸分解代谢的第一步是转氨作用。据研究报道表明，BAT2基因编码的支链氨基酸转氨酶在高级醇特别是异丁醇和异戊醇的生成过程中起着非常重要的作用。因此，为了降低发酵过程中高级醇的生成量，敲除对高级醇有重要影响的氨基酸转氨酶编码基因BAT2将是一条有效的途径。因此，本专利技术将以氨基酸转氨酶编码基因BAT2为靶基因在酿酒酵母中构建一种高效的无痕敲除方法，该方法可广泛应用于酵母及其他微生物的基因改造，为直接在工业菌株中进行基因敲除提供了有益的参考。构建的低产高级醇突变菌株可安全用于工业生产，满足酿酒酵母应用相关领域对酵母的要求。
技术实现思路
：本专利技术解决的技术问题是提供一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除的方法，并用该方法构建了一株低产高级醇的酿酒酵母菌株。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对基因BAT2的无痕敲除。本专利技术所构建的低产高级醇酵母菌株是对出发菌株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC32315单倍体α5中的完整氨基酸转氨酶编码基因BAT2进行无痕敲除来实现。具体为酿酒酵母Hα5(500)ΔH。所述BAT2基因其GeneID为：853613，核苷酸序列如表所示。上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如JosephSambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。用PCR方法扩增出HERP1.0片段，将该片段克隆至YEp352质粒，构建YHERP1.0质粒；用PCR方法分别扩增敲除靶基因BAT2上游和下游长度为500bp和683bp的同源序列片段，然后通过融合PCR获得无缝融合片段；将该片段克隆至质粒YHERP1.0上，获得重组质粒YHERP1.0(500)；用PCR方法分别扩增敲除靶基因上游597bp及YHERP1.0(500)上的片段；通过醋酸锂转化法将这两个片段同时导入酿酒酵母中，经过YPGly+AF筛选培养基进行第一步整合的筛选，获得含抗性基因的突变株；用半乳糖诱导培养基30℃，180rpm培养24h，稀释100倍后涂布于含有5-氟-2’-脱氧尿苷的合成培养基平板上，30℃培养36h，获得第二步整合重组的酿酒酵母菌株。所述酿酒酵母在生长性能与发酵性能不受影响情况下，在第二次整合重组敲除筛选标记过程的概率为6.86×10-4。本专利技术所述酿酒酵母菌株(Hα5(500)ΔH)可以用于白酒生产中。本专利技术同时提供了对于诱导培养基的优化，探究了诱导培养基中半乳糖的含量对其第二步整合重组概率的影响如表1，操作过程如下：1、诱导培养基中半乳糖的含量共设制0.1g/100mL，0.5g/100mL，1g/100mL，2g/100mL，3g/100mL，4g/100mL，5g/100mL八个梯度，蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL。2、将Hα5(500)突变株用半乳糖培养基进行诱导培养24h。稀释100倍后涂布含有5-氟-2’-脱氧尿苷的合成培养基平板。3、表1第二步整合重组的概率本专利技术的积极效果如下：1、本专利技术提供一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除的方法，克服了传统基因敲除中筛选标记残留、不便进行多基因敲除的困难。同时该专利技术不仅可以用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且由于所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。2、本专利技术提供的低产高级醇酿酒酵母在保持本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对基因BAT2的无痕敲除。

【技术特征摘要】
1.一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对基因BAT2的无痕敲除。2.根据权利要求1所述的高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：步骤如下：用PCR方法扩增出HERP1.0片段，将该片段克隆至YEp352质粒，构建YHERP1.0质粒；用PCR方法分别扩增敲除靶基因BAT2上游和下游长度为500bp和683bp的同源序列片段，然后通过融合PCR获得无缝融合片段；将该片段克隆至质粒YHERP1.0上，获得重组质粒YHERP1.0(500)；用PCR方法分别扩增敲除靶基因上游597bp及YHERP1.0(500)上的片段；通过醋酸锂转化法将这两个片段同时导入酿酒酵母中，经过YPGly+AF筛选培养基进行第一步整合的筛选，获得含抗性基因的突变株；用半乳糖诱导培养基30℃，180rpm培养24h，稀释100倍后涂布于含有5-氟-2’-脱氧尿苷的合成培养基平板上，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，肖冬光，李凭，王建辉，郭学武，陈叶福，董健，杜丽平，马立娟，于爱群，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12