The invention discloses an efficient and traceless knockout method in Saccharomyces cerevisiae, and optimizes the forward homologous sequence, galactose concentration and galactose induction time of the traceless gene knockout system. The probability of the second step of homologous recombination is 6.86*10.
【技术实现步骤摘要】
一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用
：本专利技术涉及基因工程领域，具体是在酿酒酵母中构建一种高效的无痕基因敲除方法并用该方法构建了一株低产高级醇的酿酒酵母菌株。
技术介绍
：酿酒酵母是一种典型的真核细胞模型和重要的模式生物，它的特性包括：生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等，这些特性使酿酒酵母更方便于进行基因工程和遗传学研究，称为真核生物中的“大肠杆菌”。随着分子生物学以及基因工程技术的不断发展和不断更新，酿酒酵母的育种方法已经由最初的自然育种发展为现代的定向基因工程育种。基因敲除(geneknockout)是20世纪80年代末发展起来的一种遗传工程技术，是通过适当的方法使机体特定的基因缺失或失活，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。但是随着公众对食品安全的关注，通过传统遗传学方法构建的菌株，由于残留非本身的外源基因，其生产应用受到限制。因此应用无痕敲除技术敲除机体的特定基因成为目前遗传育种的发展方向。酵母菌的无痕修饰起初是为了除去筛选标记，以便在单个菌株中进行多基因操作。去除筛选标记主要有两种方法，一种是利用重组酶介导的敲除系统，例如...
【技术保护点】
1.一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对基因BAT2的无痕敲除。
【技术特征摘要】
1.一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对基因BAT2的无痕敲除。2.根据权利要求1所述的高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：步骤如下：用PCR方法扩增出HERP1.0片段，将该片段克隆至YEp352质粒，构建YHERP1.0质粒；用PCR方法分别扩增敲除靶基因BAT2上游和下游长度为500bp和683bp的同源序列片段，然后通过融合PCR获得无缝融合片段；将该片段克隆至质粒YHERP1.0上，获得重组质粒YHERP1.0(500)；用PCR方法分别扩增敲除靶基因上游597bp及YHERP1.0(500)上的片段；通过醋酸锂转化法将这两个片段同时导入酿酒酵母中，经过YPGly+AF筛选培养基进行第一步整合的筛选，获得含抗性基因的突变株；用半乳糖诱导培养基30℃，180rpm培养24h，稀释100倍后涂布于含有5-氟-2’-脱氧尿苷的合成培养基平板上，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张翠英，肖冬光，李凭，王建辉，郭学武，陈叶福，董健，杜丽平，马立娟，于爱群，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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