耐药大肠杆菌噬菌体及其应用制造技术

耐药大肠杆菌噬菌体及其应用。分类命名为Escherichia phage vB_EcoP‑EG1，保藏号为：CCTCC M 2018562，保藏日期为2018年8月21日。噬菌体Escherichia phage vB_EcoP‑EG1性质稳定，生命周期短，对宿主菌裂解能力强。基因组及蛋白质谱结果表明噬菌体Escherichia phage vB_EcoP‑EG1不编码毒性蛋白质。同时噬菌体Escherichia phage vB_EcoP‑EG1能够感染裂解多株临床随机分离得到的多耐药的大肠杆菌，尤其对尿道致病性大肠杆菌具有良好的杀伤效果。综上所述，Escherichia phage vB_EcoP‑EG1是噬菌体治疗的良好候选噬菌体，可以作为单独的制剂或者和其他噬菌体混合组成鸡尾酒制剂用于对抗临床多耐药性大肠杆菌导致的感染。

Drug-resistant Escherichia coli Phage and Its Application

Drug-resistant E. coli bacteriophage and its application. The classification is named Escherichia phage vB_EcoP_EG1, and the storage number is CCTCC M 2018562. The storage date is August 21, 2018. The bacteriophage Escherichia phage vB_EcoP_EG1 has stable properties, short life cycle and strong lysis ability to host bacteria. Genome and protein profiles showed that the phage Escherichia phage vB_EcoP_EG1 did not encode toxic proteins. At the same time, the bacteriophage Escherichia phage vB_EcoP_EG1 can infect several clinically randomly isolated multidrug-resistant Escherichia coli, especially the pathogenic Escherichia coli of urethra. To sum up, Escherichia phage vB_EcoP_EG1 is a good candidate for bacteriophage therapy, and can be used as a single preparation or a cocktail preparation mixed with other phages to fight clinical multi-drug resistant E. coli infection.

【技术实现步骤摘要】
耐药大肠杆菌噬菌体及其应用
本专利技术属于微生物医学工程领域，具体涉及一株可以裂解临床分离的多株耐药大肠杆菌噬菌体及其应用。
技术介绍
毒性噬菌体能够感染裂解细菌，在上个世纪初就被应用于杀灭病原菌。随后由于廉价有效的抗生素的发现并大规模应用而逐渐被忽视，只有少数东欧国家(如格鲁吉亚，俄国等)一直坚持采用噬菌体疗法。近年来由于耐药菌的不断出现，噬菌体再次受到人们重视，尤其最近十几年大量针对耐药菌的新的噬菌体被发现并广泛研究。很多体外体内实验证明噬菌体能够杀灭多种耐药菌，如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌等。最近一些临床成功案例也鼓舞人们采用噬菌体来治疗严重的耐药菌导致的感染，如美国加州大学圣地亚哥分校精神病学教授TomPatterson感染了多耐药鲍曼不动杆菌引起败血症，在抗生素治疗无效的情况下，采用相应的噬菌体静脉注射及腹腔注射治疗最终成功战胜了感染,有力证明了噬菌体治疗的安全性及有效性，是抗生素治疗的有益补充。美国国立卫生研究院过敏与感染研究所已经把噬菌体列为对抗耐药菌的重要手段之一。抗生素的长期使用导致多耐药的大肠杆菌广泛出现，特别是能产生超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶的大肠杆菌，只有极少数最新抗生素有效，给临床治疗带来了极大的困难。随着新抗生素的研发周期不断变长，甚至面临着无药可用的窘境。寻找新的能杀灭多耐药大肠杆菌的替代疗法或补充疗法迫在眉睫。研究发现T4、T6和KEP10噬菌体在体外能够有效的杀灭临床分离得到的多耐药尿道致病性大肠杆菌，在小鼠尿路感染模型腹腔注射T4噬菌体或KEP10噬菌体可以抑制尿路感染症状降低小鼠的死亡率。T1噬菌体能感染裂解临床分离的大肠杆菌的耐药株，同时还能杀灭黏附在尿路上皮细胞上的多耐药的大肠杆菌。格鲁吉亚已经商品化的大肠杆菌噬菌体鸡尾酒制剂能较为有效的杀灭临床分离得到的多耐药的尿道致病性大肠杆菌。实验证明噬菌体还可以降解由大肠杆菌形成的生物膜。另外抗生素的长期使用会使粪便中携带的多耐药大肠杆菌数量升高，从而导致女性尿路感染的发生率提高10倍。动物实验表明噬菌体能够特异性的杀灭肠道污染的多重耐药的大肠杆菌，降低尿路感染风险，对正常菌群影响较小，符合现代精准治疗的需求。以上研究表明毒性噬菌体能够有效杀灭多耐药大肠杆菌。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一株新的裂解耐药大肠杆菌的噬菌体及其应用。技术方案：大肠杆菌噬菌体，分类命名为EscherichiaphagevB_EcoP-EG1，保藏号为：CCTCCM2018562，保藏日期为2018年8月21日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心。所述的噬菌体在制备抗大肠杆菌的生物制剂中的应用。所述的噬菌体在制备抗多耐药的大肠杆菌的生物制剂中的应用。所述的噬菌体在多耐药的大肠杆菌细菌分型中的应用。所述的噬菌体在表达蛋白或者运送药物的载体中的应用。一种抗多耐药的大肠杆菌的生物制剂，包括所述的噬菌体。有益效果：本专利技术EscherichiaphagevB_EcoP-EG1噬菌体对多株临床分离得到的多耐药的大肠杆菌具有良好的杀伤效果。该噬菌体可以单独应用，或者作为有效组分和其他噬菌体组成鸡尾酒制剂，或者作为抗生素辅助制剂用于杀伤抑制多耐药的大肠杆菌。附图说明图1噬菌体的形态图，其中A.噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1在双层琼脂平板上形成的噬菌斑。B.噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1的电镜照片。图2噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1的性质图，其中A.噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1在不同温度下的活性B.噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1在人的尿液中的稳定性C.噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1的生长曲线D.噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1对大肠杆菌的抑制效果实验。图3噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1对大肠杆菌形成的生物膜的抑制效果图。表1：EscherichiaphagevB_EcoP-EG1的宿主谱分析表2：噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1病毒颗粒的蛋白质组分的质谱分析具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术的专利技术方法进行详细描述和说明。其内容是对本专利技术的解释而非限定本专利技术的保护范围。在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例11.噬菌体的初步分离和纯化采集污水样品并处理：利用大肠杆菌MG1655对南京废水中的强毒噬菌体进行分离富集。从南京市污染河道中取污水样本，将污水样品用0.45μm过滤器过滤除菌。取污水滤液1mL和MG1655过夜培养菌液500μL置于5mL液体LB培养基，200rpm37℃恒温振荡培养24小时，富集噬菌体。取1mL培养液，14000g离心10分钟，取上清用0.45μm滤膜过滤。取10μL滤液，加入100μL过夜菌液(MG1655)，再加入3.5mL上层琼脂(半固体LB培养基)混匀，铺于LB琼脂平板上(双层琼脂平板法)，过夜培养后观察噬菌斑形成。初次分离的噬菌体大小、形态均不同，可能含有多种噬菌体。挑选单个噬菌斑开始第二轮扩增后铺双层琼脂平板形成噬菌斑，重复感染铺板循环直至得到大小、形态、分布均一的噬菌斑，即为得到单一纯化的噬菌体，然后将此噬菌体扩增并储存在4℃备用。可见该过夜培养后噬菌体在平板上形成的噬菌斑直径较大，约为13mm，对大肠杆菌裂解能力强(图1A)。2.EscherichiaphagevB_EcoP-EG1噬菌体的超离纯化大肠杆菌MG1655过夜培养液1:100转接到50mL液体LB培养基，培养到对数期加入噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1。侵染2小时后收集菌液，14000g4℃离心10m，上清液通过0.45μm孔径过滤器，得到噬菌体粗提取物。将上清液进行超高速离心，106750g，4℃离心2小时(BeckmanSW32转子，超速离心)。弃上清，加1mLSMbuffer重新溶解噬菌体沉淀。重悬后噬菌体进行氯化铯密度梯度离心，210053g，4℃离心20h(Beckman,SW41转子)。离心结束后每层1mL将样品分层取出。噬菌体对应层样品加入SMbuffer稀释后，加入到12mL超离管，210053g，4℃离心3h(BeckmanSW41转子)，沉淀噬菌体。离心后弃上清，稍干燥后加入100μLSMbuffer溶解噬菌体并保存于4℃，即为纯化后的噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1。3.噬菌体的形态学观察纯化的噬菌体EscherichiaphagevB_EcoP-EG1颗粒固定在带有碳涂布膜的铜格栅上(噬菌体滴度≥109PFU/mL)自然吸附约3min，用滤纸稍吸干后再用2％(W/V)磷钨酸负染2-3min，滤纸稍吸干，待干燥后采用FEITecnaiG2SpiritBioTWIN透射电子显微镜下进行观察拍照(图1B)，电镜的工作电压为80kV。该噬菌体为短尾噬菌体，头部直径大约50nm，有一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大肠杆菌噬菌体，分类命名为Escherichia phage vB_EcoP‑EG1，保藏号为：CCTCC M 2018562，保藏日期为2018年8月21日。

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌噬菌体，分类命名为EscherichiaphagevB_EcoP-EG1，保藏号为：CCTCCM2018562，保藏日期为2018年8月21日。2.权利要求1所述的噬菌体在制备抗大肠杆菌的生物制剂中的应用。3.权利要求1所述的噬菌体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓秋，古雨，于鑫焱，刘根焰，张学森，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32