一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种仿生嵌入固定化酶‑改性磷脂微囊的制备方法，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备；(2)改性磷脂微粒的制备；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒；(4)酶‑改性磷脂微囊的分离。本发明专利技术通过电磁‑超声耦合处理对磷脂进行改性，可改变其空间结构，有利于酶蛋白的嵌入，并且能提高嵌合的稳定性，利用培养基质液及制造脉冲生物电，模拟仿生环境，提高酶活力，从而提高酶蛋白嵌入成功率。利用本发明专利技术的方法制备的酶‑改性磷脂微囊作为药物载体，相较于普通纳米脂质载体，药物的溶解度可提高1.9‑2.1倍。

Preparation of biomimetic immobilized enzyme-modified phospholipid microcapsules

The invention discloses a preparation method of biomimetic immobilized enzyme modified phospholipid microcapsules, which comprises the following steps: (1) preparation of modified phospholipid; (2) preparation of modified phospholipid particles; (3) biomimetic embedding of enzyme protein into modified phospholipid particles; (4) separation of enzyme modified phospholipid microcapsules. The invention modifies phospholipids by electromagnetic and ultrasonic coupling treatment, which can change their spatial structure, facilitate the embedding of enzyme proteins, and improve the stability of the chimerism. By using culture medium and manufacturing pulsed bioelectricity, the bionic environment is simulated, and the enzyme activity is improved, thereby improving the success rate of the embedding of enzyme proteins. The enzyme modified phospholipid microcapsule prepared by the method of the invention can be used as a drug carrier, and the solubility of the drug can be increased by 1.9 2.1 times compared with the common Nano-lipid carrier.

【技术实现步骤摘要】
一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法
本专利技术涉及膜酶活性科研实验研究
，具体涉及一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法。
技术介绍
生物膜的组分繁多，分离纯化的难度较大，因此早年为便于研究，往往采用单一或几种脂质组成的各种人工膜结构：单分子层膜、累积膜、脂质体、平板双分子层脂膜等，同时，生物膜上还有大量的酶结合位点，也可将蛋白质嵌入后组成重建膜，这些膜结构泛称“人工膜”。1965年，英国学者BanghamAD把磷脂分散到过量水中，形成了一种由双分子膜组成的闭合磷脂微囊，这一发现开创了新的研究领域。人工磷脂微囊具有类似于生物膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间，这种类膜结构使其能够包裹多种物质。因此，近些年利用脂质体可以和细胞膜融合等特点制备脂质体载体药物是人工膜的另一项比较大的拓展。为了解决溶解性差药物的低口服生物可利用率的问题，利用磷脂或卵磷脂等脂质体形成的生物膜制备的药物载体，通过将难溶药物进行包裹，提高药物溶解度，进而提高药物的利用率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：以往的人工磷脂微囊形成方法不同，所形成的磷脂微囊与酶蛋白的嵌合率低，影响其作为药物载体的成效，使得口服药物生物利用率降低。从而提供一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法。本专利技术的技术方案为：一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3-5％的磷脂溶液；S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；(2)改性磷脂微粒的制备S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25-26℃；S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10-20min，温度控制在4-10℃；S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒S1：取浓度为3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2-3次；S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2-3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8-7.3；S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50-60；S4：30℃恒温孵育40-60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；(4)酶-改性磷脂微囊的分离S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；S2：装入密封超滤膜，通入惰性气体，正压过滤16-24h；S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。进一步地，步骤(1)的S2中所述电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为2500-4000高斯，压力为0.1-0.2bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为8-10min。通过电磁-超声耦合处理，磷脂的空间结构会发生明显改变，大大提高了与酶蛋白的亲和力。进一步地，步骤(2)的S2中所述超声波震荡分散的具体操作为：采用超声波横波斜探头，将探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角，频率为25KHz，脉冲时间为10s。超声横波的震荡分散更加充分。进一步地，步骤(3)的S2中所述培养基质液包括：1.8-2.2wt％磷酸二羟基丙酮、0.5-0.7wt％脱氧胆酸钠、2.1-2.4wt％海藻糖、1.1-1.4wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液。培养基质液可为酶蛋白嵌入改性磷脂提供良好的反应环境。进一步地，步骤(3)的S4中所述石墨电极制造脉冲生物电的具体操作为：所述的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为1-6mv/cm，每间隔5min脉冲处理100-500μs。进一步地，步骤(3)的S4中所述葡萄糖的添加方法为：第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min。进一步地，步骤(4)的S2中所述正压过滤的压力为3-8bar。进一步地，所述惰性气体为氮气或者氩气，防止酶发生氧化。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)通过电磁-超声耦合处理对磷脂进行改性，可改变其空间结构，有利于酶蛋白的嵌入，并且能提高嵌合的稳定性；(2)利用培养基质液及制造脉冲生物电，模拟仿生环境，提高酶活力，从而提高酶蛋白嵌入成功率；(3)利用充入惰性气体进行正压过滤，可快速得到纯净的酶-改性磷脂微囊。(4)利用本专利技术的方法制备的酶-改性磷脂微囊作为药物载体，相较于普通纳米脂质载体，药物的溶解度可提高1.9-2.1倍。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。实施例1一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备S1：将大豆磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3％的磷脂溶液；S2：将磷脂溶液在氮气氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；电磁-超声耦合处理的方法为：电磁场处理的强度为2500高斯，压力为0.1bar，超声波频率为30KHz，处理温度为25℃，处理时间为8min。通过电磁-超声耦合处理，磷脂的空间结构会发生明显改变，大大提高了与酶蛋白的亲和力。(2)改性磷脂微粒的制备S1：向改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25℃；S2：在氮气氛围保护下将超声波横波斜探头伸入液下1cm，并与液面呈45度夹角进行超声波震荡分散，频率为25KHz，时间为10min，脉冲时间为10s，温度控制在4℃。超声横波的震荡分散更加充分。S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒S1：取浓度为3mg/ml的酶蛋白溶液在1.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2次；S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8；培养基质液包括：1.8wt％磷酸二羟基丙酮、0.5wt％脱氧胆酸钠、2.1wt％海藻糖、1.1wt％半胱氨酸，余量为30mM磷酸缓冲液。培养基质液可为酶蛋白嵌入改性磷脂提供良好的反应环境。S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50；S4：30℃恒温孵育40min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，的脉冲频率为400Hz，脉冲强度为1mv/cm，每间隔5min脉冲处理100μs。并且分3次补充葡萄糖，第一次12mg/L，第二次8mg/L，第三次5mg/L，每次间隔10min。葡萄糖添加总量为25mg/L；(4)酶-改性磷脂微囊的分离S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；S2：装入密封超滤膜，通入氮气，以3bar压力正压过滤24h；S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。实施例2一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备S1：将大豆磷脂溶解于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种仿生嵌入固定化酶‑改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3‑5％的磷脂溶液；S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁‑超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；(2)改性磷脂微粒的制备S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25‑26℃；S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10‑20min，温度控制在4‑10℃；S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒S1：取浓度为3‑5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5‑3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2‑3次；S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2‑3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8‑7.3；S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50‑60；S4：30℃恒温孵育40‑60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；(4)酶‑改性磷脂微囊的分离S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶‑改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶‑改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；S2：装入密封超滤膜，通入惰性气体，正压过滤16‑24h；S3：真空冷冻干燥得到酶‑改性磷脂微囊固体粉末。...

【技术特征摘要】
1.一种仿生嵌入固定化酶-改性磷脂微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)改性磷脂的制备S1：将磷脂溶解于去离子水中，配制成为浓度为3-5％的磷脂溶液；S2：将所述磷脂溶液在惰性气体氛围保护下进行电磁-超声耦合处理，得到改性磷脂溶液；(2)改性磷脂微粒的制备S1：向所述改性磷脂溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为3％，水浴控温至25-26℃；S2：在惰性气体氛围保护下进行超声波震荡分散，时间为10-20min，温度控制在4-10℃；S3：真空冷冻干燥后得到改性磷脂微粒；(3)酶蛋白仿生嵌入改性磷脂微粒S1：取浓度为3-5mg/ml的酶蛋白溶液在1.5-3.5kv/cm范围内，经工频电场处理5min，激活酶蛋白活力，再利用高速匀浆机匀浆处理2-3次；S2：将改性磷脂微粒利用等体积比的磷酸缓冲液复溶，复溶液体再与2-3倍体积比的培养基质液混合，调节pH至6.8-7.3；S3：加入处理过的酶蛋白溶液，使得酶蛋白与磷脂的质量比为1:50-60；S4：30℃恒温孵育40-60min，期间利用石墨电极制造脉冲生物电，模拟仿生环境，并且分3次补充葡萄糖，葡萄糖添加总量为25mg/L；(4)酶-改性磷脂微囊的分离S1：离心，弃上清，用10mM磷酸缓冲液对酶-改性磷脂微囊充分洗涤，再将酶-改性磷脂微囊重悬于100倍体积的10mM磷酸缓冲液中；S2：装入密封超滤膜，通入惰性气体，正压过滤16-24h；S3：真空冷冻干燥得到酶-改性磷脂微囊固体粉末。2.如权利要求1所述的一种仿...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东,37