改进的发酵工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括步骤(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取速率qS来应用给料策略，其中qS设定为接近细胞培养物的维持率，和(c)从细胞培养物中分离所述POI。

Improved Fermentation Technology

The present invention provides a method for producing recombinant target protein (POI), including steps (a) culturing cells in a cell culture medium, expressing the POI by adding a feed containing at least one matrix to the cell culture, (b) applying feeding strategies based on calculating, setting and optionally controlling the specific matrix uptake rate qS of cells during induction and/or POI production stages. Slightly, where qS is set to approximate the maintenance rate of the cell culture, and (c) the POI is separated from the cell culture.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的发酵工艺
本专利技术涉及使用新型的给料策略生产高产率的重组蛋白的发酵方法。
技术介绍
生物技术和生物工程在现代工业和健康领域中发挥着越来越重要的作用。许多新的重要的活性药物成分是重组治疗性蛋白。通过很好地控制基因修饰的微生物中的生物技术工艺，这些重组治疗性蛋白在基因修饰的微生物中形成。生物过程开发旨在识别和理解工艺参数与产品质量和数量之间的相互作用。由于生物过程开发的时间有限，并且生物过程的多变量研究是时间、成本和劳动密集型任务，因此需要策略来加速工艺开发并缩短生物技术产品的上市时间。除了诸如pH值和温度的技术参数外，营养物的供应是影响细胞生理的主要参数。在整个诱导阶段，这种给料策略可以是(a)技术上控制的，例如，预先限定的给料曲线：体积恒定或体积变化。尽管作为工艺参数的给料速率在技术上控制到恒定的水平，但生理上仍然是不受控制的。在这种没有任何反馈控制的系统中，并没有可能的响应以改变细胞培养物的生理状态，即作为诱导重组蛋白质生产的结果。(b)或者，可以生理上控制给料策略，这意味着目标细胞(thecellsofinterest)的生理状态的定量。与技术相反，基于历史或文献数据作为固定产率模型，生理控制通常解释生理状态和/或相关变化。或者，用实时测量(例如溶解氧的浓度、介电常数、光密度、废气浓度)来调整反应生理中的给料策略。更具体地，生理的给料策略解释了反应器中生物质的量。因此，生理的给料策略依赖于在单个固定时间点估计反应器中的生物质或在整个诱导阶段及时解决。这种生物质估计是用于计算和控制技术上不可直接估计的生理细胞培养物变量的基础。到目前为止，这些给料策略主要集中在比细胞生长速率(specificcellgrowthrate)μ(Gnothetal.,2008a,Ramirezetal.,1994)。生物质比基质摄取速率(biomass-specificsubstrateuptakerate)qS很少受到控制(Sagmeisteretal.,2013)。无论目标生理变量如何，生产率或最大比滴度(specifictiter)与C-源供应在整个诱导阶段的相互关系都是非常令人感兴趣的。Ramirez等(1994)表明，重组大肠杆菌生产青霉素酰基转移酶的典型Luedeking-Piret动力学，qP与μ以及qS呈正相关。平均地，在相应的实验中μ和qS在这种情况下通过恒定产率系数YX/S(0.56g/g)相互关联。这表明，在这种特别的重组蛋白表达系统中，平均qS不影响平均生物质产率。总之，在这种情况下，更高的μ以及更高的qS导致更高的qP。Dietzsch等(2011年)用生物体巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)描述了通过控制qS影响qP的可能性。此项工作也表明了高qS值对重组蛋白生产的积极作用。Dietzsch等还表明，除了qS水平外，qS随时间变化的轨线对生产率有显著的影响。还报道了逐步增加给料模式的积极影响。通过费力的离线取样来进行生物质测量。Wechselberger等(2012)描述了高qS值对大肠杆菌中重组蛋白的生产率的积极影响。Wechselberger等还表明，qSinit的影响可以充分解释体积恒定的给料曲线的影响。由此，基于生物质比基质摄取速率qS([g/g/h])，在诱导点计算体积恒定的给料速率。数据分析表明，通过将体积恒定的给料速率初始缩放至预定的qS值，qS与比产物活性(specificproductactivity)之间明显的比例相关性。WO2013/006479公开了一种对细胞生长具有更大的控制的培养哺乳动物细胞的方法，以实现高产物滴度细胞培养物。通过用含有确定的L-天冬酰胺浓度的无血清灌注培养基灌注，在生产阶段诱导细胞生长停滞。每天取样以评估培养物。YangJD等描述了一种控制的给料灌注工艺，该工艺导致增加的单克隆抗体生产率。通过补充消耗的成分同时将关键的生产代谢物的营养物维持在低水平以使毒性代谢物的形成最小化来实现受控制的给料(YangJDetal.,BiotechnologyandBioengineering2000，69(1)：74-82)。JourdierE.等描述了里氏木霉(Trichodermareesei)在乳糖上生产纤维素酶的简单动力学模型。该模型允许在工业限制下模拟和比较不同的培养策略(JourdierE.etal.,ChemicalEngineeringTransactions2012：313-318)。ButlerM描述了在不同的动物细胞培养物中(例如中国仓鼠卵巢(CHO)、小鼠骨髓瘤(NS0)、婴儿主肾(BHK)、人胚肾(HEK-293)或人视网膜来源的(PER-C6)细胞)中生产生物药剂的成就和前景(ButlerM.，AppliedMicrobiologyandBiotechnology2005，68(3)：283-291)。如所引用的实例所示，在文献中主要发现的信息是关于最大比活性和给料至培养物的营养物的正相关性。对于每种给料控制均是如此，通过μ-控制或通过qS-控制。期望提供一种用于产生最大量的活性蛋白的高效的生物工艺的改进的方法。因此，本专利技术的目的是提供一种用于发酵产物的改进的方法，其使用最大比滴度和基质可利用性令人惊讶的负相关性。
技术实现思路
通过所要求保护的主题来解决本专利技术的目的。根据本专利技术，提供了一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取率qS来应用给料策略，其中qS设定为接近细胞培养物的维持率；和(c)从细胞培养物中分离所述POI。根据一个具体的实施例，将比基质摄取速率qS设定在细胞培养物的维持率的范围内，例如0.03-0.15g/g/h，优选地为0.05-0.12g/g/h，更优选地为0.08-0.12g/g/h，最优选地qS约为0.12g/g/h。根据一个具体的实施例，在设定为确定值后，控制或不控制比基质摄取速率qS。根据一个具体的实施例，在所述目标蛋白的产生阶段至少50％的时间内，将比基质摄取速率qS控制在恒定值(+/-15％)，其中qS为0.03g/g/h、0.04g/g/h、0.05g/g/h、0.06g/g/h、0.07g/g/h、0.08g/g/h、0.09g/g/h、0.1g/g/h、0.11g/g/h、0.12g/g/h、0.13g/g/h、0.14g/g/h、或0.15g/g/h，最优选地为0.12g/g/h。根据一个具体的实施例，通过调节给料速率设定至少一次比基质摄取速率qS，或在所述目标蛋白的产生阶段至少50％的时间内控制比基质摄取速率qS，其中qS在0.15至0.05g/g/h的范围内，优选地从0.15减少至等于或小于0.12g/g/h，从0.15减少至0.10g/g/h，从0.15减少至0.07g/g/h，从0.15减少至0.05g/g/h，从0.12减少至0.1g/g/h，从0.12减少至0.07g/g/h，从0.12减少至0.05g/g/h，从0.1减少至0.07g/g/h，从0.1减少至0.05g/g/h，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取速率qS来应用给料策略，其中qS设定为接近细胞培养物的维持率，和(c)从细胞培养物中分离所述POI。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 EP 16158294.51.一种生产重组目标蛋白(POI)的方法，包括：(a)在细胞培养基中培养细胞，通过向所述细胞培养物中加入包含至少一种基质的给料来表达所述POI，(b)在诱导阶段和/或POI产生阶段期间，基于计算、设定和任选地控制细胞的比基质摄取速率qS来应用给料策略，其中qS设定为接近细胞培养物的维持率，和(c)从细胞培养物中分离所述POI。2.根据权利要求1所述的方法，其中qS在0.03-0.15g/g/h的范围内，优选地在0.05-0.12g/g/h的范围内，更优选地在0.08-0.12g/g/h的范围内，最优选地，qS为约0.12g/g/h。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中控制或不控制qS。4.根据权利要求3所述的方法，其中将qS控制为恒定的，在所述POI的产生阶段期间至少75％、至少80％或至少95％的时间内减少或增加。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中在所述POI的产生阶段期间至少50％的时间内将qS控制在恒定值(+/-15％)。6.根据权利要求5所述的方法，其中qS为约0.03g/g/h、0.04g/g/h、0.05g/g/h、0.06g/g/h、0.07g/g/h、0.08g/g/h、0.09g/g/h、0.1g/g/h、0.11g/g/h、0.12g/g/h、0.13g/g/h、0.14g/g/h或0.15g/g/h，最优选地，qS为约0.12g/g/h。7.根据权利要求3所述的方法，其中在所述POI的产生阶段期间至少50％的时间内控制和降低qS。8.根据权利要求6所述的方法，其中qS从0.15减少至0.05g/g/h，优选地从0.15减少至等于或小于0.12g/g/h，从0.15减少至0.10g/g/h，从0.15减少至0.07g/g/h，从0.15减少至0.05g/g/h，从0.12减少至0.1g/g/h，从0.12减少至0.07g/g/h，从0.12减少至0.05g/g/h，从0.1减少至0.07g/g/h，从0.1减少至0.05g/g/h，或从0.1减少至0.03g/g/h。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过调节给料速率来控制qS。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过反馈控制的比基质摄取速率来控制qS。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过定量生物质来生理地控制所述给料策略。12.根据权利要求11所述的方法，其中通过生物质估计/测量来确定生物质。13.根据权利要求12所述的方法，其中通过实时生物质估计/测量来确定生...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·赖歇尔特，C·赫维希，J·卡格，P·扎格迈斯特，M·丰克，
申请(专利权)人：龙沙有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH