【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有可预测和稳定的转基因表达的SSI细胞及形成方法相关申请的交叉引用本申请要求申请日为2018年10月1日的美国临时专利申请序列第62/739,546号的申请权益，该申请通过引用并入本文用于所有目的。
技术介绍
在宿主细胞中整合重组蛋白(rP)表达盒以表达异源多肽已经进行了许多年。传统上，使用随机整合(RI)过程，其利用基因组中现有的双链断裂来掺入表达盒。不幸的是，由于位置花斑效应，在RI过程中，整合的基因拷贝数和整合位点处的表达特征都可能高度可变，从而产生不期望的表型异质性。因此，在开发有用的细胞系时，RI过程需要对整合事件进行昂贵的筛选。此外，用于增加表达的基因扩增方法可以引起基因组中的不稳定性(例如，缺失、重复、易位)以及表达修饰表观遗传作用(例如，甲基化、组蛋白修饰、异染色质侵入)。因此，RI产生的细胞系通常不稳定，并且随着时间的推移显示出降低的产量。最近，已经开发了位点特异性整合(SSI)，其中通过整合来自位点特异性重组酶系统诸如酿酒酵母衍生的FLP-Frt系统或噬菌体P1衍生的Cre-loxP系统的重组靶位点(RTS)...
【技术保护点】
1.一种哺乳动物细胞，包括在第一高整合(HI)基因座处染色体整合的第一重组靶位点(RTS)，所述第一HI基因座位于可及染色质的活性基因组区室内和拓扑相关结构域(TAD)边界的约30,000个碱基对内，所述第一HI基因座与所述细胞基因组中的与至少一个增强子元件相互作用的区域重叠。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181001 US 62/739,5461.一种哺乳动物细胞，包括在第一高整合(HI)基因座处染色体整合的第一重组靶位点(RTS)，所述第一HI基因座位于可及染色质的活性基因组区室内和拓扑相关结构域(TAD)边界的约30,000个碱基对内，所述第一HI基因座与所述细胞基因组中的与至少一个增强子元件相互作用的区域重叠。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第一HI基因座包括SEQIDNO：1-125中的一个，或者在SEQIDNO.：1-125中的任何一个的5′端或3′端的约5,000个碱基对内或与之重叠。
3.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第一HI基因座与所述活性基因组区室中的转录起始位点(TSS)重叠。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述TSS与活性基因可操作地连接，所述活性基因的表达或缺乏表达对于所述哺乳动物细胞是不重要的。
5.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第一HI基因座不与基因座重叠。
6.根据权利要求1所述的细胞，其中所述第一HI基因座不与基因座的原位内源启动子重叠。
7.根据权利要求6所述的细胞，其中所述第一HI基因座不在所述启动子的约1,000个碱基对之内。
8.根据权利要求1所述的细胞，包括第二不同RTS。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中所述第一不同RTS和所述第二不同RTS被染色体整合在所述第一HI基因座内。
10.根据权利要求8所述的细胞，其中所述第二不同RTS被染色体整合在第二HI基因座内。
11.根据权利要求8所述的细胞，其中所述第二不同RTS被染色体整合在单独的基因座。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述单独的基因座是Fer1L4基因座。
13.根据权利要求1所述的细胞，包括多个附加的不同RTS。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞，其中所述RTS中的至少一个是frt位点、lox位点、rox位点或att位点。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞，其中所述RTS中的至少一个包括选自SEQIDNO.：126-155的序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是小鼠细胞、人细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-DG44细胞、CHOK1SVTM或其变体、CHO谷氨酰胺合成酶敲除细胞或其变体、HEK细胞、HEK293细胞或其贴壁或悬浮适应变体、HeLa细胞或HT1080细胞。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的细胞，进一步包括第一目的基因，其中所述第一目的基因是染色体整合的。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述第一目的基因包括报告基因、选择基因、治疗目的基因、辅助基因或其组合。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述治疗目的基因包括编码难以表达的蛋白的基因。
20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述难以表达的蛋白选自由Fc-融合蛋白、酶、膜受体或单克隆抗体组成的组。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的细胞，其中所述第一目的基因位于两个所述RTS之间。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的细胞，其中所述第一目的基因位于所述第一HI基因座内。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的细胞，进一步包括第二目的基因，其中所述第二目的基因是染色体整合的。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述第二目的基因位于所述第一HI基因座内。
25.根据权利要求23所述的细胞，其中所述第一目的基因位于所述第一HI基因座内，并且所述第二目的基因位于第二HI基因座内或单独的基因座内。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的细胞，进一步包括第三目的基因，其中所述第三目的基因是染色体整合的。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述第三目的基因位于所述第一HI基因座内或位于所述第二HI基因座内或者位于或位于所述单独的基因座内。
28.根据权利要求27所述的细胞，其中
a.所述第一目的基因、所述第二目的基因和所述第三目的基因中的至少一个位于所述第一HI基因座内，并且
b.所述第一目的基因、所述第二目的基因和所述第三目的基因中的至少一个位于所述第二HI基因座内。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的细胞，进一步包括位点特异性重组酶基因。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述位点特异性重组酶基因是染色体整合的。
31.一种用于生产重组细胞的方法，包括：
a.映射细胞基因组的可及染色质中的峰；
b.在映射的峰中鉴定所述可及染色质的活性基因组区室中以及拓扑相关结构域(TAD)边界的约30,000个碱基对中的第一组峰；
c.在所述第一组峰内定义第一高整合(HI)基因座，所述第一HI基因座与所述基因组中的与至少一个增强子元件相互作用的区域重叠；和
d.在所述第一HI基因座内插入第一重组靶位点(RTS)。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一HI基因座包括SEQIDNO.：1-...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·M·奥卡拉汉，S·贝万，R·扬，P·法拉色，L·张，
申请(专利权)人：龙沙有限公司，巴布拉罕姆研究所，辉瑞大药厂，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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