一种组织特异性敲除斑马鱼基因的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种组织特异性敲除斑马鱼基因的方法及应用。具体地，本发明专利技术提供了高效且组织特异性的斑马鱼基因敲除方法以及用于该方法的核酸构建物。本发明专利技术还提供了表达此核酸构建物的载体、试剂、宿主细胞。本发明专利技术简便地可以获得多重转基因效果，转基因效率大大提高，并可进一步简化筛选步骤，简单方便地获得目标转基因斑马鱼。

【技术实现步骤摘要】
一种组织特异性敲除斑马鱼基因的方法及应用
本专利技术涉及转基因动物领域，具体地，涉及一种组织特异性敲除斑马鱼基因的方法及应用。
技术介绍
斑马鱼是研究发育和疾病的重要模式动物。其幼鱼小巧透明，组织系统既有一定的代表性和保守性，同时又有一定的复杂度，方便在实验室现有的各种操作手段下，动态地观察组织器官发育和各种生理活动。为充分发挥斑马鱼在研究上的诸多优势，需要建立斑马鱼的组织特异性的基因敲除方法。目前，在斑马鱼中，产生全基因功能缺失的方法已成熟，并已经被广泛应用。然而，在特定组织和细胞类型中特异敲除基因的技术还很不成熟，这是目前制约斑马鱼研究领域发展的瓶颈之一。因此，本领域急需一种高效且组织特异性的斑马鱼基因敲除方法，以实现在特定组织和细胞类型中敲除基因功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效且组织特异性的斑马鱼基因敲除方法，以实现在特定组织和细胞类型中敲除基因功能。本专利技术的第一方面，提供了一种核酸构建物I，所述的构建物具有从5'到3'的式I结构：LA-X-RA(I)式中，LA、X、RA分别为用于构成所述构建物的元件；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；LA为改造后的左同源臂序列；X为第一外源基因表达盒；RA为右同源臂序列；所述的元件LA序列和RA序列使得所述构建物与斑马鱼染色体目标区段发生定点非同源重组，所述的目标区段为斑马鱼靶基因3'端包含内含子、外显子、终止子和3'UTR区段，且在目标区段的内含子序列中包含一段单导向RNA(sgRNA)靶序列；所述的LA定点重组的位点位于目标区段的5'端的内含子和外显子直至终止子前的序列，且LA序列(5'→3')包含所述单导向RNA(sgRNA)靶序列和一段操作性连接的核酸构建物II。在另一优选例中，所述的目标区段的序列长度为1000-6000bp。在另一优选例中，所述的同源臂序列长度为200-5000bp，较佳地为500-3000bp，更佳地为1000-2000bp。在另一优选例中，所述的核酸构建物I的目标区段定点重组的位点位于斑马鱼20号染色体上的hey2基因区域，具体地位于NC_007131的第39589569位至39591030位。在另一优选例中，所述的核酸构建物I的目标区段为斑马鱼hey2基因的第5个外显子E5和含有sgRNA靶序列的一段内含子序列。在另一优选例中，所述的sgRNA靶序列长度为18-24nt；较佳地，为19-22nt。在另一优选例中，所述的sgRNA靶序列靶向hey2基因的一段内含子序列。在另一优选例中，所述的内含子序列，即hey2sgRNA靶序列为GGAAGGATAATGGTTGGGT(SEQIDNO.:2)，其中PAM为AGG。在另一优选例中，所述的核酸构建物I的核酸序列如SEQIDNO.:1所示，其中所述的LA左同源臂序列的核酸序列为SEQIDNO.:1所示核酸序列的第1–3309位，所述的第一外源基因表达盒X的核酸序列为SEQIDNO.:1所示核酸序列的第3310–4098位，和所述的RA右同源臂的核酸序列为SEQIDNO.:1所示核酸序列的第4099–5205位。所述的SEQIDNO.:1的序列如下所示：atgatcttattttgactaagcgtggctatgaagcagaaaggaaggataatgagttgggtaggttaggtaagactttcttagacatgagtcaggtcaaagacaacagataattccataaaacatatgtattttttgtattctatagaattgtcattaatattcatgcaaaagatttcttaagtgacatttgcaaatcactccagttgtgtctttctttacattgttttccagttaaatttaggattgatttctgttatttatttagaataataattgtatattaataatgatattgggcagtatattgtactgtaccctgctgctggaagggtatccatatggggtggttcgcccagggtgttgttacacaagtgaaagagcatcgacagggtaatttgctagcttaccggtttacgcgtataacttcgtatagcatacattatacgaagttatccaagcttcaccatcgacccgaattgccaagcatcaccatcgacccataacttcgtatagtacacattatacgaagttatttcgaacgtaatacgactcactatagggcgaattggagctccaccggtggcggccgctctagaactagtggatcctggttctttccgcctcagaagccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggctgatcagcggtttctggttctttccgcctcagaagccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggctgatcagcgagctccaccgcggtcaattaagtttgtgccccagtttgctagggaggtcgcagtatctggccacagccacctcgtgctgctcgacgtaggtctctttgtcggcctccttgattctttccagtctgtggtccacatagtagacgccgggcatcttgaggttcttagcgggtttcttggatctgtatgtggtcttgaagttgcagatcaggtggcccccgcccacgagcttcagggccatgtcgcttctgccttccaggccgccgtcagcggggtacagcatctcggtgttggcctcccagccgagtgttttcttctgcatcacagggccgttggatgggaagttcacccctctgatcttgacgttgtagatgaggcagccgtcctggaggctggtgtcctgggtagcggtcagcacgcccccgtcttcgtatgtggtgac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建物I，其特征在于，所述的构建物具有从5'到3'的式I结构：/nLA-X-RA (I)/n式中，/nLA、X、RA分别为用于构成所述构建物的元件；/n各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；/nLA为改造后的左同源臂序列；/nX为第一外源基因表达盒；/nRA为右同源臂序列；/n所述的元件LA序列和RA序列使得所述构建物与斑马鱼染色体目标区段发生定点非同源重组，所述的目标区段为斑马鱼靶基因3'端包含内含子、外显子、终止子和3'UTR区段，且在目标区段的内含子序列中包含一段单导向RNA(sgRNA)靶序列；且/n所述的LA定点重组的位点位于目标区段的5'端的内含子和外显子直至终止子前的序列，且LA序列(5'→3')包含所述单导向RNA(sgRNA)靶序列和一段操作性连接的核酸构建物II。/n

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物I，其特征在于，所述的构建物具有从5'到3'的式I结构：
LA-X-RA(I)
式中，
LA、X、RA分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
LA为改造后的左同源臂序列；
X为第一外源基因表达盒；
RA为右同源臂序列；
所述的元件LA序列和RA序列使得所述构建物与斑马鱼染色体目标区段发生定点非同源重组，所述的目标区段为斑马鱼靶基因3'端包含内含子、外显子、终止子和3'UTR区段，且在目标区段的内含子序列中包含一段单导向RNA(sgRNA)靶序列；且
所述的LA定点重组的位点位于目标区段的5'端的内含子和外显子直至终止子前的序列，且LA序列(5'→3')包含所述单导向RNA(sgRNA)靶序列和一段操作性连接的核酸构建物II。


2.如权利要求1所述的核酸构建物I，其特征在于，所述的核酸构建物I的核酸序列如SEQIDNO.:1所示，其中所述的LA左同源臂序列的核酸序列为SEQIDNO.:1所示核酸序列的第1–3309位，所述的第一外源基因表达盒X的核酸序列为SEQIDNO.:1所示核酸序列的第3310–4098位，和所述的RA右同源臂的核酸序列为SEQIDNO.:1所示核ss酸序列的第4099–5205位。


3.如权利要求1所述的核酸构建物I，其特征在于，所述的一段操作性连接的核酸构建物II，所述的构建物具有从5'到3'的式II结构：
L5-L5'-Y-L3-L3'(II)
式中，
L5、L5'、X、L3、L3'分别为用于构成所述构建物的元件；
各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
L5为5'第一位点特异性重组序列；
L5'为5'第二位点特异性重组序列；
Y为倒置的第二外源基因表达盒；
L3为3'第一位点特异性重组序列；
L3'为3'第二位点特异性重组序列；
且，所述的RA定点重组的位点位于目标区段的3'端的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳，杜久林，李红羽，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：上海;31