一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC‑PLGA导管及其应用，所述雪旺细胞与神经干细胞联合LC‑PLGA导管的连接方法如下：首先将神经断端近心端套入LC‑PLGA导管内，套入长度为1mm，神经断端外膜与神经导管以10‑0缝合线缝合，然后将22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞和3.75μl神经干细胞混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。本发明专利技术还包括雪旺细胞与神经干细胞联合LC‑PLGA的应用，应用于神经修复。本发明专利技术制备的上述修复神经导管具有很好的生物相容性、可降解性；且应用时可很好地促进受损神经的修复，具有很好的应用前景。

A LC-PLGA catheter with Schwann cells and neural stem cells and its application

The invention relates to a Schwann cell and nerve stem cell combined LC PLGA catheter and its application. The connecting method of Schwann cell and nerve stem cell combined LC PLGA catheter is as follows: first, the proximal end of nerve broken end is inserted into the LC PLGA catheter, the length is 1mm, the epineurium of nerve broken end is sutured with nerve conduit by 10 0 suture line, and then 22.5 mu atrigel, 3.75 mu Schwann fine is sutured. The mixture of cells and 3.75 ml NSCs was injected into the catheter. The distal end of the catheter was treated in the same way. The distance between nerve ends in the catheter was 5 mm. The invention also includes the application of Schwann cells and neural stem cells combined with LC PLGA for nerve repair. The repairing nerve conduit prepared by the invention has good biocompatibility and biodegradability, and can promote the repairing of damaged nerves well in application, and has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用
本专利技术涉及生物医用材料
，具体地说，是一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用。
技术介绍
由于现代社会生产和生活节奏的不断加快，人们受到伤害的几率大大增加。由于事故导致的损伤，常常伴有外周神经系统的损伤。神经损伤由于组织不能成功的再生，经常引起功能的长期丧失。周围神经损伤是一种常见的全球临床问题，这大大影响了患者的生活质量，并造成了巨大的社会经济负担。周围神经损伤或缺损时，人们首先选用的方法是将两侧神经断端直接吻合。如果不能直接吻合，由于周围结缔组织等的障碍作用，则会导致新生的神经纤维无法通过缺损部位到达其靶组织所在部位，在再生神经的残端形成增生的神经瘤样组织，其结果是造成创伤所在肢体的功能障碍。另外，也有采用自体神经移植的方法修复周围神经损伤或者神经外膜、神经束膜缝合进行修复，但是供体神经来源受限，且均需要进行缝合容易出现感觉神经纤维与运动神经纤维的错接以及断端瘢痕组织侵入，使用自体神经移植的方法，也存在会造成取材部位的功能缺损，被移植神经的部位功能恢复也不理想，而异体神经移植存在着无法克服的免疫排斥反应等问题。根据近年来已经被众多学者证实的神经选择再生理论，采用人工神经鞘管进行周围神经修复成为一个理想替代方法，其主要是利用断端留出空间提供选择性再生空间诱导损伤神经再生。然而现有技术的神经修复材料多采用生物不可降解的材料制成，一般需要采用二次手术进行去除。而且现有的神经修复导管制备方法单一，导致神经修复导管性能受限，或者只能满足强度要求但较难实现物质传递，或者容易实现物质传递但强度差。神经损伤修复的研究已经有近百年的历史，究其原因主要是损伤局部的微环境不利于神经纤维的再生和向靶部位延伸。近年来，人们采用坐骨神经移植、人工材料导管等方法已经证明大鼠脊髓损伤后，只要改善局部的微环境，离断的神经纤维是可以再生的。但是，由于导管的生物相容性、力学性能等问题，现在还没有较为理想的用于脊髓再生的人工神经导管。中国专利申请：CN101579246B公开了一种神经修复导管及其制备方法，所述神经修复导管由内层导管和外层纤维壁构成，所述内层导管由沿导管延展方向排列的丝素蛋白纤维构成，所述外层纤维壁由垂直导管环绕轴向排列的丝素蛋白纤维构成，所述丝素蛋白纤维的直径为50～3000nm；制备上述神经修复导管的方法，包括以下步骤：(1)制备再生丝素蛋白膜；(2)溶解纯再生丝素蛋白膜，使用静电纺丝纺制备丝素蛋白纤维；(3)通过滚筒装置收集丝素蛋白纤维得到神经修复导管；所述神经修复导管为高纯度蚕丝丝素蛋白，内层为沿导管延展方向排列的平行纤维；外层纤维环绕导管轴向排列。中国专利申请：CN105983136A公开了一种神经修复导管其制备方法，神经修复导管包括：内层和设于所述内层外壁的外层；所述内层由胶原、壳聚糖及其衍生物中的一种或者多种复合材料制得，所述外层由胶原、壳聚糖、丝素蛋白及其衍生物中的一种或者多种复合材料制得。但是关于本专利技术一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管及其应用目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种雪旺细胞与神经干细胞联合LC-PLGA导管。本专利技术的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述导管的制备方法。本专利技术的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述导管的应用。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA(LC-PLGA)导管，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法具体如下：(1)制备LC-PLGA导管：将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.1％浓度的壳聚糖溶液中(壳聚糖溶液的成分为：壳聚糖质量百分比3.5％，醋酸4％，水92.5％)，30min后取出用细毛刷刷去导管表面多余的壳聚糖，然后置于自然条件下晾干，最后将导管置于70℃恒温烘箱干燥定型，15min后取出并将导管内的芯轴抽出，将制备好的导管浸泡在层粘连蛋白(LN，0.2mg/ml)水溶液中，20min后取出水洗2次，这样就完成了一个LN膜的制备，重复上述步骤可以在PLGA导管表面进行LN多层膜，为了保持层粘连蛋白的活性，整个实验过程均在冰浴中进行，最后将制备好的Laminin-chitosan-PLGA神经导管裁剪成7mm长，备用；(2)神经干细胞的获取及培养：SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部施行“T”形切口，充分暴露并拉出子宫，可见成串珠样排列的胚胎，结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，并用PBS冲洗除去血细胞，眼科剪小心剪开子宫，取出胚胎，并使用显微镊离断胎头，在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，然后分离出海马组织，将海马组织转移至规格为3.5mm预先铺有DMEM/F12(1:1)的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，然后将细胞悬液以750rpm/min的转速离心3min，将上清液转移至15ml离心管中，1500rpm/min转速离心5min，弃上清，细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基(NSCM)重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次。(3)雪旺细胞的获取及培养：取3-5天新生SD大鼠，颈椎脱臼处死后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，使用眼科剪将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1溶液混合，置于37℃摇床45min-1h，然后置于离心机中以1500rpm/min的转速离心5min，弃上清，使用SCCM重悬，将细胞种于10cm细胞培养皿，每隔一天换液，视细胞生长情况传代，传代时弃去细胞上清液，加入3ml浓度为0.2％的Dispase(消化前，酶37℃水浴箱温热半小时)，细胞培养箱消化10-15min，轻轻拍打，显微镜下观察，雪旺细胞大部分消化下来即可，以1500rpm/min的转速离心5min，SCCM重悬后以1×106的密度种植于10cm培养皿中；(4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管：将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管内，神经断端套入长度约为1mm，神经断端外膜与神经导管以10-0缝合线缝合，然后将约22.5μlmatrigel、3.75μl雪旺细胞(约0.083×106个)与3.75μl神经干细胞(约0.083×106个)混合物注入导管内，远心端以同样的方法处理，导管内神经断端间距为5mm。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种如上所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法，包括以下步骤：(1)制备LC-PLGA导管：将由东华大学提供的PLGA导管，浸渍于0.1％浓度的壳聚糖溶液中(壳聚糖溶液的成分为：壳聚糖质量百分比3.5％，醋酸4％，水92.5％)，30min后取出用细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin‑chitosan‑PLGA导管，其特征在于，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin‑chitosan‑PLGA导管的制备方法具体如下：(1)制备Laminin‑chitosan‑PLGA导管：首先将PLGA导管浸渍于浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，30min后将其取出并刷去导管表面的壳聚糖，然后做晾干及干燥处理，15min后将PLGA导管内的芯轴抽出得到chitosan‑PLGA导管；最后将制备好的chitosan‑PLGA导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的层粘连蛋白水溶液中，20min后将其取出水洗，并在chitosan‑PLGA导管表面进行重复层粘连蛋白膜的处理得到Laminin‑chitosan‑PLGA导管，将得到的Laminin‑chitosan‑PLGA导管剪切成长度为7mm的导管，备用；(2)神经干细胞的获取及培养：首先将SPF级别孕14‑16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部切口，将子宫拉出并结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D‑Hanks液的培养皿中，同时用PBS对其进行冲洗，然后将子宫剪开并取出胚胎，同时使用显微镊离断胎头；在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，分离出海马组织，将分离出的海马组织转移至预先铺有DMEM/F12的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，将细胞悬液离心处理，最后将得到的细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次；(3)雪旺细胞的获取及培养：首先将3‑5天新生SD大鼠颈椎脱臼处死，之后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D‑Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，并将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1的溶液混合，然后进行振荡、离心，弃上清并重悬，最后将细胞种于细胞培养皿，每隔一天换液并传代；(4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin‑chitosan‑PLGA导管：首先将神经断端的近心端套入Laminin‑chitosan‑PLGA导管，神经断端近心端的套入长度为1mm，再将神经断端外膜与Laminin‑chitosan‑PLGA导管以10‑0缝合线缝合；然后将matrigel、雪旺细胞和神经干细胞的混合物注入Laminin‑chitosan‑PLGA导管内；最后将神经断端的远心端以同近心端的处理方式进行处理。...

【技术特征摘要】
1.一种雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管，其特征在于，所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管的制备方法具体如下：(1)制备Laminin-chitosan-PLGA导管：首先将PLGA导管浸渍于浓度为0.1％的壳聚糖溶液中，30min后将其取出并刷去导管表面的壳聚糖，然后做晾干及干燥处理，15min后将PLGA导管内的芯轴抽出得到chitosan-PLGA导管；最后将制备好的chitosan-PLGA导管浸泡在浓度为0.2mg/ml的层粘连蛋白水溶液中，20min后将其取出水洗，并在chitosan-PLGA导管表面进行重复层粘连蛋白膜的处理得到Laminin-chitosan-PLGA导管，将得到的Laminin-chitosan-PLGA导管剪切成长度为7mm的导管，备用；(2)神经干细胞的获取及培养：首先将SPF级别孕14-16天SD大鼠脱臼处死，使用75％酒精喷洒躯干消毒，腹部切口，将子宫拉出并结扎子宫动脉后，于子宫颈处剪断，将子宫置于盛有D-Hanks液的培养皿中，同时用PBS对其进行冲洗，然后将子宫剪开并取出胚胎，同时使用显微镊离断胎头；在解剖显微镜下将大脑半球分离，并剥除血管膜，分离出海马组织，将分离出的海马组织转移至预先铺有DMEM/F12的培养皿中，使用巴斯德吸管轻柔吹打，将细胞悬液离心处理，最后将得到的细胞沉淀使用神经干细胞完全培养基重悬并计数，将细胞以1×106个/ml的密度种植于T25培养瓶中，并置于37℃，5％CO2的培养箱中，每两天换一次液，每七天传代一次；(3)雪旺细胞的获取及培养：首先将3-5天新生SD大鼠颈椎脱臼处死，之后用75％酒精消毒，在无菌条件下取出坐骨神经，使用D-Hanks液洗去血细胞，解剖显微镜下除去外膜及结缔组织，并将神经剪碎，将减碎的神经片段与0.2％NB4的体积：Dispase的体积＝3:1的溶液混合，然后进行振荡、离心，弃上清并重悬，最后将细胞种于细胞培养皿，每隔一天换液并传代；(4)连接神经干细胞、雪旺细胞和Laminin-chitosan-PLGA导管：首先将神经断端的近心端套入Laminin-chitosan-PLGA导管，神经断端近心端的套入长度为1mm，再将神经断端外膜与Laminin-chitosan-PLGA导管以10-0缝合线缝合；然后将matrigel、雪旺细胞和神经干细胞的混合物注入Laminin-chitosan-PLGA导管内；最后将神经断端的远心端以同近心端的处理方式进行处理。2.根据权利要求1所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管，其特征在于，所述Laminin-chitosan-PLGA导管内神经断端间距为5mm。3.根据权利要求1所述雪旺细胞与神经干细胞联合Laminin-chitosan-PLGA导管，其特征在于，所述步骤(1)中壳聚糖溶液的浓度为0.1％，所述壳聚糖溶液的成分及各组分的质量百分比为：壳聚糖为3.5％，醋酸为4％，水为92.5％；所述步骤(1)中在chitosan-PLGA导管表面进行层粘连蛋白膜处理时是在冰浴的条件下进行。4.一种权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：於子卫，李煜，门永芝，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31