用于治疗β-血红蛋白病的CRISPR/CAS相关方法和组合物技术

披露了用于治疗β血红蛋白病的CRISPR/CAS相关组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗β-血红蛋白病的CRISPR/CAS相关方法和组合物相关申请的引用本申请要求2016年3月14日提交的美国临时申请号62/308,190和2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456,615的权益，将其各自内容通过引用以其全文结合在此。序列表本申请含有以ASCII格式经由EFS-Web提交的序列表，并且通过引用以其全文结合在此。在2017年3月14日创建的所述ASCII副本被命名为8009WO00_SequenceListing.txt，并且大小为335KB。
本专利技术涉及用于编辑靶核酸序列或调控靶核酸序列表达的CRISPR/Cas相关方法和组分，及其与包括镰状细胞病和β-地中海贫血的β-血红蛋白病的结合应用。
技术介绍
血红蛋白(Hb)将氧气从肺部携带到红细胞或红血细胞(RBC)中的组织。在胚胎发育期间和出生后不久，血红蛋白以胎儿血红蛋白(HbF)的形式存在，胎儿血红蛋白是由两个α-珠蛋白链和两个γ-珠蛋白链组成的四聚体蛋白质。HbF在很大程度上被成人血红蛋白(HbA)替换，成人血红蛋白是一种四聚体蛋白质，其中HbF的γ-珠蛋白链通过称为珠蛋白转换的过程被β-珠蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向结构域，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.14 US 62/308,190;2017.02.08 US 62/456,6151.一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向结构域，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述HBG1或HBG2调控区域分别与HBG1或HBG2基因相邻。3.如权利要求2所述的gRNA分子，其中所述HBG1调控区域位于跨越SEQIDNO:902的核苷酸1-2990的区域。4.如权利要求2所述的gRNA分子，其中所述HBG2调控区域位于跨越SEQIDNO:903的核苷酸1-2914的区域。5.如权利要求1-4中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域被配置成在HBG靶位置的500、400、300、200、100、50、25、或10个核苷酸内提供选自双链断裂和单链断裂的切割事件。6.如权利要求1所述的gRNA分子，其中所述靶结构域完全位于HBG1或HBG2调控区域内。7.如权利要求1-6中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域被配置成靶向HBG1或HBG2调控区域中的转录调控元件。8.如权利要求7所述的gRNA分子，其中所述转录调控元件是启动子。9.如权利要求8所述的gRNA分子，其中所述启动子控制HBG1和HBG2中的一种或多种的转录。10.如权利要求7所述的gRNA分子，其中所述转录调控元件是沉默子。11.如权利要求1-10中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域包含与SEQIDNO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同或相差不超过1、2、3、4、或5个核苷酸的核苷酸序列。12.如权利要求11所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域包含与SEQIDNO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同的核苷酸序列。13.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA分子是模块化gRNA分子。14.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA分子是单分子gRNA分子。15.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA分子是嵌合gRNA分子。16.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是16个或更多个核苷酸。17.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是17个或更多个核苷酸。18.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是18个或更多个核苷酸。19.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是19个或更多个核苷酸。20.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是20个或更多个核苷酸。21.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是21个或更多个核苷酸。22.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是22个或更多个核苷酸。23.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是23个或更多个核苷酸。24.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是24个或更多个核苷酸。25.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是25个或更多个核苷酸。26.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域在长度上是26个或更多个核苷酸。27.如权利要求1-12中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子进一步包含第一互补结构域、连接结构域、第二互补结构域、近端结构域、5'延伸结构域、和尾部结构域中的一个或多个。28.如权利要求27所述的gRNA分子，所述gRNA分子从5'到3'包含：靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；和近端结构域。29.如权利要求28所述的gRNA分子，所述gRNA分子进一步包含尾部结构域。30.如权利要求1-29中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少20个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和由17或18个核苷酸组成的靶向结构域。31.如权利要求1-29中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少25个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和由17或18个核苷酸组成的靶向结构域。32.如权利要求1-29中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少30个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和由17个核苷酸组成的靶向结构域。33.如权利要求1-37中任一项所述的gRNA分子，所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少40个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和由17个核苷酸组成的靶向结构域。34.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含：(a)编码包含靶向结构域的gRNA分子的核苷酸序列，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。35.如权利要求34所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子是如权利要求1-33中任一项所述的gRNA分子。36.如权利要求34或35所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域被配置成在HBG靶位置的500、400、300、200、100、50、25、或10个核苷酸内提供选自双链断裂和单链断裂的切割事件。37.如权利要求34-36中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域包含与SEQIDNO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同或相差不超过1、2、3、4、或5个核苷酸的核苷酸序列。38.如权利要求37所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域包含与SEQIDNO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同的核苷酸序列。39.如权利要求34-38中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子是模块化gRNA分子。40.如权利要求34-38中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子是单分子gRNA分子。41.如权利要求34-38中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子是嵌合gRNA分子。42.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是16个或更多个核苷酸。43.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是17个或更多个核苷酸。44.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是18个或更多个核苷酸。45.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是19个或更多个核苷酸。46.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是20个或更多个核苷酸。47.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是21个或更多个核苷酸。48.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是22个或更多个核苷酸。49.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是23个或更多个核苷酸。50.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是24个或更多个核苷酸。51.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是25个或更多个核苷酸。52.如权利要求34-41中任一项所述的核酸组合物，其中所述靶向结构域在长度上是26个或更多个核苷酸。53.如权利要求34-52中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子进一步包含靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；和近端结构域中的一个或多个。54.如权利要求53所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子从5'到3'包含：靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；和近端结构域。55.如权利要求54所述的核酸组合物，其中所述gRNA进一步包含尾部结构域。56.如权利要求34-55中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少20个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和具有17或18个核苷酸的靶向结构域。57.如权利要求34-55中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少25个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和在长度上有17或18个核苷酸的靶向结构域。58.如权利要求34-55中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少30个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和在长度上有17个核苷酸的靶向结构域。59.如权利要求34-55中任一项所述的核酸组合物，其中所述gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少40个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和在长度上有17个核苷酸的靶向结构域。60.如权利要求34-59中任一项所述的核酸组合物，所述核酸组合物进一步包含：(b)编码RNA指导的核酸酶的核苷酸序列。61.如权利要求60所述的核酸组合物，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9分子或Cas9-融合蛋白。62.如权利要求61所述的核酸组合物，其中所述Cas9分子是具有酶活性的Cas9(eaCas9)分子。63.如权利要求62所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子包含切口酶分子。64.如权利要求62或63所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子在靶核酸中形成双链断裂。65.如权利要求62或63所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子在靶核酸中形成单链断裂。66.如权利要求65所述的核酸组合物，其中所述单链断裂形成于所述靶核酸的与所述gRNA分子的靶向结构域互补的链中。67.如权利要求66所述的核酸组合物，其中所述单链断裂形成于所述靶核酸的不同于与所述gRNA分子的靶向结构域互补的链的链中。68.如权利要求61-67中任一项所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子包含HNH样结构域切割活性，但没有或具有不显著的N-末端RuvC样结构域切割活性。69.如权利要求68所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子是HNH样结构域切口酶。70.如权利要求68或69所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子在D10处包含突变。71.如权利要求65-70中任一项所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子包含N端RuvC样结构域切割活性，但没有或具有不显著的HNH样结构域切割活性。72.如权利要求70所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子是N端RuvC样结构域切口酶。73.如权利要求71或72所述的核酸组合物，其中所述eaCas9分子在H840或N863处包含突变。74.如权利要求34-73中任一项所述的核酸组合物，所述核酸组合物进一步包含：(c)编码包含靶向结构域的第二gRNA分子的核苷酸序列，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。75.如权利要求74所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子是如权利要求1-33中任一项所述的gRNA分子。76.如权利要求74或75所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域被配置成在HBG靶位置的500、400、300、200、100、50、25、或10个核苷酸内提供选自双链断裂和单链断裂的切割事件。77.如权利要求74-76中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域包含与SEQIDNO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同或相差不超过1、2、3、4、或5个核苷酸的核苷酸序列。78.如权利要求77所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域包含与SEQIDNO:251-901中任一个所示的核苷酸序列相同的核苷酸序列。79.如权利要求74-78中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子是单分子gRNA分子。80.如权利要求74-78中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子是模块化gRNA分子。81.如权利要求74-78中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子是嵌合gRNA分子。82.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是16个或更多个核苷酸。83.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是17个或更多个核苷酸。84.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是18个或更多个核苷酸。85.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是19个或更多个核苷酸。86.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是20个或更多个核苷酸。87.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是21个或更多个核苷酸。88.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是22个或更多个核苷酸。89.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是23个或更多个核苷酸。90.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是24个或更多个核苷酸。91.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是25个或更多个核苷酸。92.如权利要求74-81中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子的所述靶向结构域在长度上是26个或更多个核苷酸。93.如权利要求74-92中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子进一步包含靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；和近端结构域中的一个或多个。94.如权利要求93所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子从5'到3'包含：靶向结构域；第一互补结构域；连接结构域；第二互补结构域；和近端结构域。95.如权利要求94所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA进一步包含尾部结构域。96.如权利要求74-95中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少20个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和具有17或18个核苷酸的靶向结构域。97.如权利要求74-95中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少25个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和在长度上有17或18个核苷酸的靶向结构域。98.如权利要求74-95中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少30个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和在长度上有17个核苷酸的靶向结构域。99.如权利要求74-95中任一项所述的核酸组合物，其中所述第二gRNA分子包含：包含不多于25个核苷酸的连接结构域；包含至少40个核苷酸的一起考虑的近端结构域和尾部结构域；和在长度上有17个核苷酸的靶向结构域。100.如权利要求74-99中任一项所述的核酸组合物，所述核酸组合物进一步包含：(d)编码包含靶向结构域的第三gRNA分子的核苷酸序列，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。101.如权利要求100所述的核酸组合物，所述核酸组合物进一步包含：(f)编码包含靶向结构域的第四gRNA分子的核苷酸序列，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。102.如权利要求34-101中任一项所述的核酸组合物，所述核酸组合物进一步包含(g)模板核酸。103.如权利要求102所述的核酸组合物，其中所述模板核酸是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。104.如权利要求103所述的核酸组合物，其中所述模板核酸包含5'同源臂、替换序列、和3'同源臂。105.如权利要求104所述的核酸组合物，其中所述5'同源臂在长度上包含约200个核苷酸，例如，长度为至少25、50、75、100、125、150、175、或200个核苷酸；所述替换序列在长度上包含0个核苷酸；并且所述3'同源臂在长度上包含约200个核苷酸，例如，长度为至少25、50、75、100、125、150、175、或200个核苷酸。106.如权利要求105所述的核酸组合物，其中所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp、HBG靶位置内的靶位点同源性5'，并且所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp、HBG靶位置内的靶位点同源性3'。107.如权利要求106所述的核酸组合物，其中所述靶位点选自下组，该组由以下组成：HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)、HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)、和HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)。108.如权利要求107所述的核酸组合物，其中所述靶位点是HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)，并且所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)的同源性5'。109.如权利要求108所述的核酸组合物，其中所述5'同源臂包含SEQIDNO:904(即，ssODN15'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。110.如权利要求108或109所述的核酸组合物，其中所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)的同源性3'。111.如权利要求108-110中任一项所述的核酸组合物，其中所述3'同源臂包含SEQIDNO:905(即，ssODN13'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。112.如权利要求107所述的核酸组合物，其中所述靶位点是HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)，并且所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)的同源性5'。113.如权利要求112所述的核酸组合物，其中所述5'同源臂包含SEQIDNO:904(即，ssODN15'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。114.如权利要求112或113所述的核酸组合物，其中所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)的同源性3'。115.如权利要求112-114中任一项所述的核酸组合物，其中所述3'同源臂包含SEQIDNO:905(即，ssODN13'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。116.如权利要求108-115中任一项所述的核酸组合物，其中所述模板核酸包含SEQIDNO:906(即，ssODN1)，基本上由其组成或由其组成。117.如权利要求107所述的核酸组合物，其中所述靶位点是HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)，并且所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)的同源性5'。118.如权利要求117所述的核酸组合物，其中所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)的同源性3'。119.如权利要求103-118中任一项所述的核酸组合物，其中所述ssODN包含5'硫代磷酸酯修饰。120.如权利要求103-118中任一项所述的核酸组合物，其中所述ssODN包含3'硫代磷酸酯修饰。121.如权利要求103-118中任一项所述的核酸组合物，其中所述ssODN包含5'硫代磷酸酯修饰和3'硫代磷酸酯修饰。122.如权利要求34-121中任一项所述的核酸组合物，其中所述核酸组合物不包含(c)编码第二gRNA分子的核苷酸序列、(d)编码第三gRNA分子的核苷酸序列、或(e)编码第四gRNA分子的核苷酸序列。123.如权利要求34-122中任一项所述的核酸组合物，其中(a)和(b)存在于一个核酸分子上。124.如权利要求101-122中任一项所述的核酸组合物，其中(a)、(b)、和(g)存在于一个核酸分子上。125.如权利要求123或124所述的核酸组合物，其中所述核酸分子是AAV载体或LV载体。126.如权利要求34-122中任一项所述的核酸组合物，其中：(a)存在于第一核酸分子上；并且(b)存在于第二核酸分子上。127.如权利要求126所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸分子是AAV载体或LV载体。128.如权利要求74-122中任一项所述的核酸组合物，其中(a)和(c)存在于一个核酸分子上。129.如权利要求101-122中任一项所述的核酸组合物，其中(a)和(g)存在于一个核酸分子上。130.如权利要求128或129所述的核酸组合物，其中所述核酸分子是AAV载体或LV载体。131.如权利要求74-122中任一项所述的核酸组合物，其中：(a)存在于第一核酸分子上；并且(c)存在于第二核酸分子上。132.如权利要求101-122中任一项所述的核酸组合物，其中：(a)存在于第一核酸分子上；并且(g)存在于第二核酸分子上。133.如权利要求130或131所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸分子是AAV载体或LV载体。134.如权利要求60-122中任一项所述的核酸组合物，其中(a)、(b)和(c)存在于一个核酸分子上。135.如权利要求101-122中任一项所述的核酸组合物，其中：(a)、(b)、和(g)存在于一个核酸分子上。136.如权利要求134或135所述的核酸组合物，其中所述核酸分子是AAV载体或LV载体。137.如权利要求60-122中任一项所述的核酸组合物，其中：(a)、(b)、和(c)之一在第一核酸分子上进行编码；并且(a)、(b)、和(c)中的第二个和第三个在第二核酸分子上进行编码。138.如权利要求101-122中任一项所述的核酸组合物，其中：(a)、(b)、和(g)之一在第一核酸分子上进行编码；以及(a)、(b)、和(g)中的第二个和第三个在第二核酸分子上进行编码。139.如权利要求137或138所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸分子是AAV载体或LV载体。140.如权利要求137或139所述的核酸组合物，其中：(a)存在于第一核酸分子上；并且(b)和(c)存在于第二核酸分子上。141.如权利要求138或139所述的核酸组合物，其中：(a)存在于第一核酸分子上；并且(b)和(g)存在于第二核酸分子上。142.如权利要求140或141所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸分子是AAV载体或LV载体。143.如权利要求137或139所述的核酸组合物，其中：(b)存在于第一核酸分子上；并且(a)和(c)存在于第二核酸分子上。144.如权利要求138或139所述的核酸组合物，其中：(b)存在于第一核酸分子上；并且(a)和(g)存在于第二核酸分子上。145.如权利要求143或144所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸分子是AAV载体或LV载体。146.如权利要求137或139所述的核酸组合物，其中：(c)存在于第一核酸分子上；并且(b)和(a)存在于第二核酸分子上。147.如权利要求138或139所述的核酸组合物，其中：(g)存在于第一核酸分子上；并且(b)和(a)存在于第二核酸分子上。148.如权利要求146或147所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸分子是AAV载体或LV载体。149.如权利要求126、131、132、137、139、140、141、143、144、146、或147中任一项所述的核酸组合物，其中所述第一核酸分子不同于AAV载体并且所述第二核酸分子是AAV载体。150.如权利要求34-149中任一项所述的核酸组合物，其中所述核酸组合物包含可操作地连接至(a)上的启动子。151.如权利要求74-149中任一项所述的核酸组合物，其中所述核酸组合物包含可操作地连接至(c)上的第二启动子。152.如权利要求151中任一项所述的核酸组合物，其中所述启动子和第二启动子彼此不同。153.如权利要求151中任一项所述的核酸组合物，其中所述启动子和第二启动子相同。154.如权利要求60-149中任一项所述的核酸组合物，其中所述核酸组合物包含可操作地连接至(b)上的启动子。155.一种组合物，所述组合物包含(a)如权利要求1-33中任一项所述的gRNA分子。156.如权利要求155所述的组合物，所述组合物进一步包含(b)RNA指导的核酸酶。157.如权利要求156所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9分子或Cas9-融合蛋白。158.如权利要求157所述的组合物，其中所述Cas9分子是具有酶活性的Cas9(eaCas9)分子。159.如权利要求158所述的组合物，其中所述eaCas9分子包含切口酶分子。160.如权利要求158或159所述的组合物，其中所述eaCas9分子在靶核酸中形成双链断裂。161.如权利要求158或159所述的组合物，其中所述eaCas9分子在靶核酸中形成单链断裂。162.如权利要求161所述的组合物，其中所述单链断裂形成于所述靶核酸的与所述gRNA分子的靶向结构域互补的链中。163.如权利要求161所述的组合物，其中所述单链断裂形成于所述靶核酸的不同于与所述gRNA分子的靶向结构域互补的链的链中。164.如权利要求158-163中任一项所述的组合物，其中所述eaCas9分子包含HNH样结构域切割活性，但没有或具有不显著的N-末端RuvC样结构域切割活性。165.如权利要求164所述的组合物，其中所述eaCas9分子是HNH样结构域切口酶。166.如权利要求164或165所述的组合物，其中所述eaCas9分子在D10处包含突变。167.如权利要求158-163中任一项所述的组合物，其中所述eaCas9分子包含N端RuvC样结构域切割活性，但没有或具有不显著的HNH样结构域切割活性。168.如权利要求167所述的组合物，其中所述eaCas9分子是N端RuvC样结构域切口酶。169.如权利要求167或168所述的组合物，其中所述eaCas9分子在H840或N863处包含突变。170.如权利要求156-169中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含(c)包含靶向结构域的第二gRNA分子，所述靶向结构域包含与完全或部分位于HBG1或HBG2调控区域内的靶结构域互补或部分互补的核苷酸序列。171.如权利要求170所述的组合物，其中所述第二gRNA分子是如权利要求1-33中任一项所述的gRNA分子。172.如权利要求156-171中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含(d)第三gRNA分子。173.如权利要求172所述的组合物，所述组合物进一步包含(e)第四gRNA分子。174.如权利要求155-173中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含(g)模板核酸。175.如权利要求174所述的组合物，其中所述模板核酸是单链寡脱氧核苷酸(ssODN)。176.如权利要求175所述的组合物，其中所述模板核酸包含5'同源臂、替换序列、和3'同源臂。177.如权利要求176所述的组合物，其中所述5'同源臂在长度上包含约200个核苷酸，例如，长度为至少25、50、75、100、125、150、175、或200个核苷酸；所述替换序列在长度上包含0个核苷酸；并且所述3'同源臂在长度上包含约200个核苷酸，例如，长度为至少25、50、75、100、125、150、175、或200个核苷酸。178.如权利要求177所述的组合物，其中所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp、HBG靶位置内的靶位点同源性5'，并且所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp、HBG靶位置内的靶位点同源性3'。179.如权利要求178所述的组合物，其中所述靶位点选自下组，该组由以下组成：HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)、HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)、和HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)。180.如权利要求179所述的组合物，其中所述靶位点是HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)，并且所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)的同源性5'。181.如权利要求180所述的组合物，其中所述5'同源臂包含SEQIDNO:904(即，ssODN15'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。182.如权利要求180或181所述的组合物，其中所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-114至-102(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2824-2836)的同源性3'。183.如权利要求179-182中任一项所述的组合物，其中所述3'同源臂包含SEQIDNO:905(即，ssODN13'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。184.如权利要求179所述的组合物，其中所述靶位点是HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)，并且所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)的同源性5'。185.如权利要求184所述的组合物，其中所述5'同源臂包含SEQIDNO:904(即，ssODN15'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。186.如权利要求184或185所述的组合物，其中所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG2c.-114至-102(例如，SEQIDNO:903(HBG2)的核苷酸2748-2760)的同源性3'。187.如权利要求184-186中任一项所述的组合物，其中所述3'同源臂包含SEQIDNO:905(即，ssODN13'同源臂)，基本上由其组成或由其组成。188.如权利要求175-187中任一项所述的组合物，其中所述模板核酸包含SEQIDNO:906(即，ssODN1)，基本上由其组成或由其组成。189.如权利要求179所述的组合物，其中所述靶位点是HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)，并且所述5'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)的同源性5'。190.如权利要求189所述的组合物，其中所述3'同源臂包含约50bp至100bp，例如，55bp至95bp、60bp至90bp、70bp至90bp、或80bp至90bp，HBG1c.-225至-222(例如，SEQIDNO:902(HBG1)的核苷酸2716-2719)的同源性3'。191.如权利要求175-190中任一项所述的组合物，其中所述ssODN包含5'硫代磷酸酯修饰。192.如权利要求175-190中任一项所述的组合物，其中所述ssODN包含3'硫代磷酸酯修饰。193.如权利要求175-190中任一项所述的组合物，其中所述ssODN包含5'硫代磷酸酯修饰和3'硫代磷酸酯修饰。194.一种改变细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与以下接触：(a)如权利要求1-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·L·戈里，L·A·巴雷拉，
申请(专利权)人：爱迪塔斯医药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US