转化体、以及转铁蛋白的制造方法技术

本发明专利技术提供使用粟酒裂殖酵母的转化体、以高生产性分泌产生转铁蛋白的方法、以及适合该方法的转化体。转化体的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有转铁蛋白基因，和存在于转铁蛋白基因的上游区域、使与在宿主内起作用的分泌信号肽结合的转铁蛋白表达的分泌信号肽基因，宿主本来具有的Gas2基因被删除或失活；并且转铁蛋白的制造方法的特征在于，在液体培养基中培养转化体，从该液体培养基取得转铁蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转化体、以及转铁蛋白的制造方法
本专利技术涉及将Schizosaccharomycespombe(以下，称为“粟酒裂殖酵母”。)作为宿主、使用整合了转铁蛋白基因的转化体、制造转铁蛋白的方法。
技术介绍
转铁蛋白(以下，也称为“TF”。)是与Fe3+离子结合的糖蛋白的1种，与铁的代谢密切相关。尤其，人血清转铁蛋白(以下，也称为“人转铁蛋白”或“hTF”。)属于人体内的铁结合蛋白质家族，参与体内的铁运输·代谢，用作对动物细胞的培养用培养基的添加剂、医药品、DDS的运输载体。TF是具有N臂(N-lobe)和C臂(C-lobe)2个结构域的约80kDa的糖蛋白，通过翻译作为在N末端具有分泌信号肽的未成熟型蛋白质被合成后，作为切断了分泌信号肽的成熟型的糖蛋白向细胞外分泌。作为TF生产的最通常的方法，已知使用仓鼠肾脏细胞(BHK细胞)等哺乳细胞的培养株生产全长重组蛋白质的方法。此外，已知使用作为裂殖酵母的粟酒裂殖酵母的方法。粟酒裂殖酵母与作为出芽酵母的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不同，细胞分裂以及转录形态与人细胞接近，不含有对人体有不良影响的物质。因此，在粟酒裂殖酵母中生产TF的全长重组蛋白质的方法作为医药品等被人摄取的TF的生产方法是优良的。例如，专利文献1中公开了将粟酒裂殖酵母作为宿主，在含有酪蛋白氨基酸的液体培养基中培养导入了hTF基因的转化体，高效地生产hTF，在液体培养基中使其分泌、回收的方法。另一方面，已知在使用酵母等真核细胞微生物的异源蛋白质生产体系中，为了提高目标异源蛋白质的生产效率，使用将对于异源蛋白质生产而言不需要或不利的宿主的基因组部分的一部分或全部删除或失活了的改良宿主。例如，专利文献2中记载了通过在粟酒裂殖酵母中使用将选自编码特定的蛋白酶的基因(蛋白酶基因簇)的至少1种的基因删除或失活了的改良宿主，提高异源蛋白质的生产效率。此外，可通过在hTF蛋白质的N末端上附加了分泌信号(内质网迁移信号)肽的状态下进行生产，来分泌生产hTF蛋白质。例如，如果培养导入了编码融合蛋白质的结构基因的粟酒裂殖酵母的转化体，则生产的该融合蛋白质在高尔基体或内质网中分泌信号肽被切断，hTF蛋白质被分泌至培养基中；该融合蛋白质在hTF蛋白质的N末端融合有像来源于与粟酒裂殖酵母的接合相关的接合信息素(P-因子)的前体的分泌信号的多肽那样、通过粟酒裂殖酵母而被识别的分泌信号肽。例如专利文献3中，记载了通过在目标外源蛋白质的N末端侧上融合有由作为具有分子伴侣功能、集中于内质网的蛋白质的PDI1(蛋白质二硫键异构酶1，Proteindisulfideisomerase1)的分泌信号肽和a结构域和b结构域和x结构域构成的部分蛋白质，或由PDI1的内质网迁移信号肽和a结构域和b结构域和b’结构域和x结构域构成的部分蛋白质的状态下使其表达，使粟酒裂殖酵母中外源蛋白质分泌生产的量增大。另外，PDI1从N末端起依次具有ER迁移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域、a’结构域、以及包含ER定位信号(ADEL)的c结构域。a结构域以及a’结构域中各有1个分子伴侣活性的活性中心(CGHC)，a结构域、b结构域、b’结构域、以及a’结构域4者一起形成硫氧还蛋白折叠。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利特开2011-125281号公报专利文献2：国际公开第2007/015470号专利文献3：国际公开第2013/111754号
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题本专利技术的目的在于提供使用粟酒裂殖酵母的转化体、以高生产性分泌产生TF的方法、以及适于该方法的转化体。解决技术问题所采用的技术方案本专利技术的转化体的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有TF基因，和存在于TF基因的上游区域、使与在宿主内起作用的分泌信号肽结合的TF表达的分泌信号肽基因，宿主本来具有的Gas2基因被删除或失活。作为该转化体，优选TF基因是编码人转铁蛋白的基因。此外，作为该转化体，TF基因是在编码哺乳动物所具有的天然型TF的基因中导入突变后的突变TF基因，突变TF基因优选编码天然型TF的至少1处作为N连接型糖链修饰部位的天冬酰胺残基缺失、或被其它氨基酸残基取代的突变TF的基因。此外，作为该转化体，优选宿主本来具有的至少1种蛋白酶基因被删除或失活。作为蛋白酶基因，更优选选自金属蛋白酶基因簇、丝氨酸蛋白酶基因簇、半胱氨酸蛋白酶基因簇以及天冬氨酸蛋白酶基因簇的基因。作为被删除或失活的蛋白酶基因，进一步优选选自psp3基因、isp6基因、ppp53基因、ppp16基因、ppp22基因、sxa2基因、ppp80基因以及ppp20基因的至少1种基因。此外，作为该转化体，优选TF基因直接或间接地连接在编码包含分泌信号肽的分泌载体蛋白质的基因的下游，更优选编码分泌载体蛋白质的基因是编码宿主的PDI1的分泌信号肽部分的基因、和编码人的PDI1的ab结构域部分的基因、和编码宿主的PDI1的x结构域部分的基因的融合基因。本专利技术的TF的制造方法的特征在于，在液体培养基中培养本专利技术的转化体，从该液体培养基取得转铁蛋白。作为该TF的制造方法，优选在pH5.5～6.5的液体培养基中培养转化体，还优选在含有腺嘌呤的液体培养基中培养转化体，还优选在将转化体培养至菌体密度(OD660)达到100以上后、从该液体培养基取得转铁蛋白。本专利技术的转化体的制造方法的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，整合在宿主内起作用的分泌信号肽基因、和位于分泌信号肽基因的下游的TF基因，以及将宿主本来具有的Gas2基因删除或失活。专利技术的效果通过培养本专利技术的转化体，可高效地制造TF。此外，通过本专利技术的TF的制造方法，可使用粟酒裂殖酵母，以高生产性分泌产生TF。附图说明图1是显示分泌表达载体pSL6PDI1(SP)Hsabx-hTF(N413QN611Q)的结构的图。图2是A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株的培养液的SDS-PAGE的CBB染色图。图3是显示A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株的hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的分泌量的经时变化的图。图4是用DEAE色谱法纯化A8-hTF(1)株以及A8-gas2Δ-hTF(1)株的培养上清中的hTF(N413Q/N611Q)蛋白质的纯化组分的SDS-PAGE的CBB染色图。具体实施方式[TF基因、分泌信号肽基因]本专利技术中，“TF基因”是指编码成熟型的TF蛋白质的结构基因。此外，以下将成熟型的TF蛋白质称为“TF蛋白质”。在本来具有TF基因的物种的细胞中，包含分泌信号肽的蛋白质(分泌载体蛋白质)和TF蛋白质连接的融合蛋白质进行表达，该融合蛋白质在内质网或高尔基体中分泌载体蛋白质被切割，TF蛋白质分泌至细胞外。另一方面，由于本专利技术中的作为宿主的粟酒裂殖酵母本来不具有TF基因，分泌载体蛋白质和TF蛋白质连接的融合蛋白质即使在宿主内进行表达，其分泌载体蛋白质也不一定能在宿主细胞内被切割。因此，作为本专利技术中的分泌信号肽或分泌载体蛋白质，优选在宿主中充分起作用的、在TF蛋白质的N末端侧上本来所具有的以外的分泌信号肽或分泌载体蛋白质。本专利技术中的“在宿主内起作用的”(分泌信号肽)是指具有将在宿主内表达的融合蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转化体，其特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有转铁蛋白基因，和存在于所述转铁蛋白基因的上游区域、使与在所述宿主内起作用的分泌信号肽结合的转铁蛋白表达的分泌信号肽基因，所述宿主本来具有的Gas2基因被删除或失活。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.12 JP 2016-0036061.一种转化体，其特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有转铁蛋白基因，和存在于所述转铁蛋白基因的上游区域、使与在所述宿主内起作用的分泌信号肽结合的转铁蛋白表达的分泌信号肽基因，所述宿主本来具有的Gas2基因被删除或失活。2.如权利要求1所述的转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因是编码来源于哺乳动物的天然型的TF蛋白质或其修饰蛋白质的基因。3.如权利要求1或2所述的转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因是编码人转铁蛋白或其修饰蛋白质的基因。4.如权利要求1或2所述的转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因是在编码哺乳动物所具有的天然型的转铁蛋白的基因中导入突变后的突变转铁蛋白基因，所述突变转铁蛋白基因为编码天然型转铁蛋白的至少1处作为N连接型糖链修饰部位的天冬酰胺残基缺失、或被其它氨基酸残基取代的突变转铁蛋白的基因。5.如权利要求4所述的转化体，其特征在于，所述转铁蛋白基因是在编码人所具有的天然型的转铁蛋白的基因中导入了突变的突变转铁蛋白基因。6.如权利要求1～5中任一项所述的转化体，其特征在于，所述宿主本来具有的至少1种的蛋白酶基因被删除或失活。7.如权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述蛋白酶基因为选自金属蛋白酶基因簇、丝氨酸蛋白酶基因簇、半胱氨酸蛋白酶基因簇以及天冬氨酸蛋白酶基因簇的基因。8.如权利要求6或7...

【专利技术属性】
技术研发人员：依地热斯·阿里木江，熊谷博道，小岛千明，
申请(专利权)人：AGC株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP