通过大规模平行RNA测序分析母亲血浆转录组制造技术

本发明专利技术为通过大规模平行RNA测序分析母亲血浆转录组，本发明专利技术提供了使用来自妊娠女性对象的样品用于诊断妊娠相关的病症、确定等位基因比、确定母亲或胎儿对于循环转录体的贡献，和/或鉴定母亲或胎儿标记物的方法。也提供了在妊娠女性对象中用于诊断妊娠相关的病症的基因的用途。

Analysis of maternal plasma transcription group by large-scale parallel RNA sequencing

The present invention provides a method for analyzing maternal plasma transcripts by large-scale parallel RNA sequencing. Samples from pregnant women are used to diagnose pregnancy-related diseases, determine allele ratios, determine the contribution of mothers or fetuses to circulating transcripts, and/or identify maternal or fetal markers. It also provides the use of genes for diagnosing pregnancy-related disorders in pregnant women.

【技术实现步骤摘要】
通过大规模平行RNA测序分析母亲血浆转录组相关申请的交叉引用本申请要求2013年2月28日提交的题目为“通过大规模平行RNA测序分析母亲血浆转录组”的美国临时专利申请号61/770,985的优先权，为了所有的目的将其通过引用并入本文。
技术介绍
已经报道了母亲血浆中妊娠特异性的细胞外RNA分子1。它们已经提供了通过简单地使用来自母亲的外周血液样品用于胎儿评估和妊娠监测的无创测试工具。迄今为止，已经使用母亲血浆RNA开发了许多有希望的产前诊断应用2-8。研究人员已经积极搜索另外的RNA标记物，以便在将应用延伸在不同的胎儿病症和妊娠病理学背景下。理论上，最直接的RNA标记物鉴定方法是直接描述母亲血浆中的细胞外RNA分子。但是，该方法是不容易的，因为常规的高通量筛选技术，比如微阵列分析和基因表达的系列分析(SAGE)，具有有限的能力检测通常低浓度的母亲血浆中部分降解的细胞外RNA9。而是，大部分报告的RNA标记物筛选策略通过比较胎盘和母亲血细胞的表达概况而间接操作10。仅仅表达在胎盘中比在母亲血细胞中表达更高的转录体进一步在母亲血浆样品中通过高灵敏度但是低通量技术，比如实时逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)研究。迄今，通过该间接方法鉴定的血浆RNA标记物相对有限。该可能因为基于组织的挖掘策略未充分考虑影响母亲血浆中胎盘RNA水平的所有的生物因素。另外，由非胎盘组织响应妊娠表达和释放的转录体可能不被该方法鉴定。所以非常期望允许直接概述母亲血浆转录组的灵敏和高通量方法。类似地，直接血浆RNA概述可用于有来自两个个体的RNA分子的混合物的其他情形，比如用于器官移植。移植接受者的循环包含来自供体和接受者的核酸分子。由供体或接受者提供的RNA分子相关图谱的改变可揭示移植器官或接受者的病理学，比如移植排斥。专利技术概述提供方法、系统和装置用于诊断妊娠相关的病症，确定等位基因比，确定母亲或胎儿对循环转录体的贡献，和/或使用来自妊娠女性对象的样品鉴定母亲或胎儿标记物。在一些实施方式中，样品是包含源自母亲和胎儿的RNA分子的混合物的血液血浆。分析(例如，测序)RNA分子，以获得多个读数，和鉴定参考序列中这些读数的位置(例如，通过序列比对)。信息型基因座鉴定为对于母亲或胎儿中的第一等位基因是纯合子，和对于母亲和胎儿中另一个的第一等位基因和第二等位基因是杂合子。然后过滤信息型基因座并且进一步分析位于(例如，对齐)过滤信息型基因座的读数。在一些实施方式中，计算对应第一等位基因和第二等位基因的读数的比例并且与截取值比较，以诊断妊娠相关的病症。在一些实施方式中，使用位于信息型母亲基因座的读数测定胎儿起源的样品中的一部分RNA。在一些实施方式中，计算个体过滤信息型基因座的对应第一等位基因和第二等位基因的读数的比例，并且比例与截取值比较，以指定基因座为母亲或胎儿标记物。本专利技术不限于产前诊断并且可施用至包含源自两个个体的RNA分子混合物的任何生物样品。例如，可使用获得自器官移植接受者的血液血浆样品。移植器官中表达的转录体反映供体的基因型并且在接收者的血液中以可检测的水平出现。通过读取这些转录体，可鉴定在供体和接受者二者的基因中表达的信息型基因座，并且可测量来自每个个体的等位基因的相对表达水平。仅仅由于供体或接受者等位基因的异常表达水平可用于诊断移植相关的病症。可用于本专利技术的生物样品包括血液、血浆、血清、尿、唾液和组织样品。例如，已经在妊娠女性的尿中检测到胎儿核酸。肾移植接受者的尿已经显示包含无细胞核酸和来自移植器官的细胞。在许多情况下已经观察到微嵌合。微嵌合指身体中存在来自另一人的细胞或核酸来源，包括具体个体的器官和组织。在甲状腺、肝、脾、皮肤、骨髓和其他组织的活组织检查中已经观察到微嵌合。微嵌合可由于之前的妊娠或输血而出现。也提供了基因用于诊断妊娠女性对象中妊娠相关的病症的用途。基因的表达水平与从每个孕育健康胎儿的一个或多个其他女性对象确定的对照值比较。本文解决的妊娠相关的病症包括先兆子痫、宫内生长限制、侵入性胎盘形成和早产。其他妊娠相关的病症可以是使胎儿处在胎儿死亡风险的病况，比如新生儿的溶血病、胎盘功能不足、胎儿水肿、胎儿畸形。仍其他妊娠相关的疾病可以是妊娠期间导致并发症的病况，比如母亲的HELLP综合症、系统性红斑狼疮和其他免疫疾病。附图说明图1显示血浆中的等位基因比B/A与各自基因的相对表达水平之间的。图2显示总基因表达水平与基因的相对表达水平之间的关系。图3是诊断妊娠相关病症的方法的流程图。图4和5显示RNA-seq读取比对结果的总结。图6显示来自测序两个个体的血液血浆RNA的数据。图6A显示从M9356P的RNA-seq文库(用Ribo-ZeroGold预处理)和M9415P(不用Ribo-ZeroGold预处理)测序读数的GC％分布。图6B显示M9356P和M9415P之间基因表达概况的相关性。图7显示母亲血浆中不同RNA转录体的RNA-SNP等位基因比和总血浆浓度，针对相对组织表达水平(胎盘/血细胞)绘图。图8显示包含信息型SNP的不同基因的RNA-SNP等位基因比和总血浆水平，针对相对组织表达水平(血细胞/胎盘)绘图。图9显示母亲血浆中胎儿特异性SNP等位基因的RNA-SNP等位基因比和包含这些等位基因的RNA转录体的表达水平。图10显示母亲血浆中母亲特异性SNP等位基因的RNA-SNP等位基因比和包含这些等位基因的RNA转录体的表达水平。图11显示先兆子痫和对照对象中母亲特异性SNP等位基因的数据。图11A显示病例5641(第三个三个月晚发型先兆子痫)和病例7171(对照)对包括母亲特异性SNP等位基因的信息型SNP的RNA-SNP等位基因比。图11B显示病例5641相对于7171(对照)的那些就包括母亲特异性SNP等位基因的信息型SNP的RNA-SNP等位基因比和血浆水平的倍数差异。图12显示先兆子痫和对照对象中母亲特异性SNP等位基因的数据。图12A显示病例5641(第三个三个月晚发型先兆子痫)和病例9356(对照)的包括母亲特异性SNP等位基因的信息型SNP的RNA-SNP等位基因比。图12B显示RNA-SNP等位基因比和病例5641血浆水平相对于9356的那些，包括母亲特异性SNP等位基因的信息型SNP的倍数差异。图13显示图11表格形式的数据。图14显示图12表格形式的数据。图15是在来自女性对象孕育胎儿的样品中确定胎儿起源的一部分RNA的方法的流程图。图16显示母亲血浆转录组的信息型SNP分析的结果。图17显示晚期妊娠的母亲血浆样品中没有过滤等位基因特异性表达的相对胎儿和母亲贡献。图18显示母亲血浆转录组中的胎儿和母亲贡献。图18A显示早期妊娠和晚期妊娠的母亲血浆中源自胎儿和母亲的转录体的比例。图18B显示分娩之前和之后等位基因计数和胎儿等位基因比。图19比较在一个RNA-SNP对于先兆子痫病例和对照妊娠病例的部分胎儿和母亲贡献。图20是将基因组基因座指定为母亲或胎儿标记物的方法的流程图。图21是妊娠相关的基因的列表。图22显示与分娩前相比，分娩后对象中更低表达水平的妊娠相关的基因。图23显示使用131个妊娠相关的基因，血浆样品的分级聚类。图24显示胎盘、母亲血细胞和母亲血浆中131个妊娠相关的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于在孕育胎儿的女性对象中诊断妊娠相关的病症的系统，所述系统包括用于将图21或图26中所示基因的表达水平与从一个或多个其他女性对象测定的对照值比较的装置，其中每一个所述其他女性对象孕育健康胎儿，其中所述基因不是CSH1、KISS1、TFPI2、PLAC4、CSHL1、SERPINE1、PAPPA、ADAM12、GH2、INHBA、PSG9、PLAC1、SERPINB2、CRH或GCM1。

【技术特征摘要】
2013.02.28 US 61/770,9851.用于在孕育胎儿的女性对象中诊断妊娠相关的病症的系统，所述系统包括用于将图21或图26中所示基因的表达水平与从一个或多个其他女性对象测定的对照值比较的装置，其中每一个所述其他女性对象孕育健康胎儿，其中所述基因不是CSH1、KISS1、TFPI2、PLAC4、CSHL1、SERPINE1、PAPPA、ADAM12、GH2、INHBA、PSG9、PLAC1、SERPINB2、CRH或GCM1。2.权利要求1所述的系统，其中所述妊娠相关的病症与所述女性对象相关。3.权利要求1所述的系统，其中所述妊娠相关的病症与所述胎儿相关。4.权利要求3所述的系统，其中所述诊断妊娠相关的病症是先兆子痫或早产。5.权利要求1所述的系统，其中如果所述表达水平超过所述对照值，则诊断所述妊娠相关的病症。6.权利要求1所述的系统，其中如果所述表达水平低于所述对照值，则诊断所述妊娠相关的病症。7.权利要求1所述的系统，其中与分娩之后比较，所述女性对象当妊娠时展示升高的基因表达水平。8.权利要求1所述的系统，其中所述女性对象的所述基因的表达水平通过如下测量：获得来自所述女性对象的血浆样品，接收多个序列读数，其中所述序列读数获自从所述血浆样品获得的RNA分子的分析；通过计算机系统鉴定参考序列中序列读数的位置；和计数位于所述基因处的序列读数。9.计算机可读介质，其储存多种指令，其中所述指令当被处理器执行时诊断孕育胎儿的女性对象中妊娠相关的病症，所述多种指令包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢煜明，赵慧君，陈君赐，江培勇，徐宝贤，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81