一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒和检测胎儿甲基化DNA拷贝数的方法技术

本发明专利技术涉及医学技术领域，公开了一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒和检测胎儿甲基化DNA拷贝数的方法。本发明专利技术所述试剂盒包括母体血浆游离核酸提取试剂、特异性核酸片段富集试剂盒、数字PCR检测试剂和贡献系数表。本发明专利技术通过设立每个与染色体非整数倍有关的染色体的甲基化差异核酸片段的贡献系数，通过贡献系数来消除每次免疫共沉淀所带来的沉淀效率不同的影响，完善了胎儿染色体异常的无创检测方法，使得检测结果更加贴近于真实检测结果，同时完全不依赖于胎儿核酸在母亲血浆样本中的占比问题，极大程度上解决了超早期筛查所面临的胎儿占比较低的问题。

A Kit for Detecting Non-integer Multiplication of Fetal Chromosomes and a Method for Detecting Copies of Fetal Methylated DNA

The invention relates to the field of medical technology, and discloses a kit for detecting non-integer multiple of fetal chromosome and a method for detecting copy number of fetal methylated DNA. The kit comprises a maternal plasma free nucleic acid extraction reagent, a specific nucleic acid fragment enrichment reagent kit, a digital PCR detection reagent and a contribution coefficient table. The invention establishes Contribution Coefficients of methylation differential nucleic acid fragments of each chromosome related to non-integer multiple of chromosome, eliminates the influence of different precipitation efficiency caused by each immune coprecipitation by contribution coefficients, improves the non-invasive detection method of fetal chromosome abnormalities, makes the detection results closer to the real detection results, and completely independent of fetal nucleus. The proportion of acid in maternal plasma samples has largely solved the problem of low proportion of fetuses in ultra-early screening.

【技术实现步骤摘要】
一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒和检测胎儿甲基化DNA拷贝数的方法
本专利技术涉及医学
，特别涉及一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒和检测胎儿甲基化DNA拷贝数的方法。
技术介绍
产前诊断是预防缺陷儿出生的有效检测方法，当前已受到广泛重视，具体的检查方式分为有创和无创。有创的检测方法主要是胎儿绒毛取样和羊膜穿刺等，该检测方法存在导致胎儿流产的风险，因此在临床上的应用存在一定的局限性。近年来无创产前诊断越来越受到人们的关注。孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现为无创产前诊断提供了重要的研究依据。研究表明正常孕妇外周血浆中胎儿游离DNA占比范围是3-20％，并且随着孕周时间的延长，胎儿游离核酸占比越高。利用母体血浆中胎儿游离DNA进行无创产前诊断已被证明是一种检测非整倍体胎儿(如唐氏)的高灵敏度和特异性的方法。唐氏综合征即21-三体综合征，又称先天愚型或Down综合征，是由染色体异常(多了一条21号染色体)而导致的疾病。60％患儿在胎内早期即流产，存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。目前基于NGS技术平台，已成功建立21三体、18三体、13三体筛查试剂盒相关技术平台，并获得成功的市场推广。但NGS技术的缺点也比较明显，目前市场推广的无创筛查技术，最终消费价格为2000元左右。数字PCR技术采用绝对定量的策略，能够直接读取目标片段的拷贝数，在低拷贝序列、拷贝数变异、突变检测、基因相对表达量研究等方面具有很大的优势。有研究表明，胎儿胎盘组织与孕妇外周血样本存在基因组甲基化程度不一致的现象，有一些基因在胎儿组织中处于高度甲基化状态，由此可利用亚硫酸氢盐处理、甲基化敏感限制性内切酶或者甲基化DNA免疫共沉淀技术等方法进行胎儿核酸片段富集，最终在数字PCR进行精确定量，通过适合的反应体系对胎儿染色体变异给出明确的判定结果。如CN102625854A就公开了这种类似的用于检测染色体非整倍性的方法。理论上这些特定的甲基化差异核酸片段，经过亚硫酸氢盐处理技术、甲基化敏感限制性内切酶技术或DNA免疫共沉淀技术，可完全区分开母亲和胎儿核酸片段，可实际情况是，不同的胎儿特定甲基化核酸片段间的甲基化程度存在差异，所以各个胎儿甲基化核酸片段获取效率不同，即便是同一个甲基化核酸片段每次的洗脱效率都会不同，这就会造成每次检测的样本量不同，通过数字PCR获得的拷贝数也会不同，最终造成检测结果出现偏差。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒，使得所述试剂盒能够消除因甲基化程度不同引起的染色体非整数倍的检测误差；本专利技术的另外一个目的在于提供利用上述试剂盒检测胎儿特定甲基化核酸片段拷贝数的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒，包括母体血浆游离核酸提取试剂、特异性核酸片段富集试剂盒、数字PCR检测试剂和贡献系数表；其中，所述贡献系数表由以下方式获得：步骤1、确定与染色体非整数倍相关的染色体上具备甲基化差异的核酸片段为目的基因，选取与染色体非整数倍无关的染色体上的任意核酸片段为参比基因；步骤2、以正常染色体倍数的胎儿绒毛或新生儿血液为样本提取DNA，设计上述各目的基因和参比基因的引物探针对，通过数字PCR检测获得各目的基因和参比基因的拷贝数；步骤3、从目的基因中选择一个或两个以上做为靶基因，将所选择的目的基因的平均拷贝数记为所述靶基因的拷贝数，将各目的基因(包括作为靶基因的目的基因)的拷贝数和各参比基因拷贝数分别与所述靶基因的拷贝数相比，所得系数为剩余的各目的基因和各参比基因的贡献系数；步骤4、重复步骤2和步骤3多次，选择每次所获得的贡献系数误差在±0.2内(含0.2)的目的基因和参比基因为实际检测时的使用基因，其任意一次获得的贡献系数或多次所获得的贡献系数的平均值组成贡献系数表。其中，当选择两个以上目的基因作为靶基因时，需要选择甲基化程度一致的目的基因，经处理后，可获得相同拷贝数的基因；针对目前临床应用产品中，还不存在根据贡献系数来平衡实验误差的试剂盒，本专利技术中首次将各基因贡献系数应用到临床检测中，从而平衡误差，提高检测准确度。作为优选，本专利技术所述母体血浆游离核酸提取试剂包括裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠和蛋白酶K。其中，裂解液包括7-9M盐酸胍、2-6M异硫氰酸胍、10-50mMEDTA和20-100mMTris-HCl；结合液包含异丙醇和乙醇，其中异丙醇和乙醇的体积百分比均优选为30-70％，此外还可包含保护核酸不被降解，或促进核酸与蛋白解离的成分，如SDS、TritonX-100等成分；漂洗液是异丙醇、乙醇、裂解液，三者配比以达到将核酸以外的其他杂质去除为适宜配比，其中异丙醇：乙醇：裂解液的体积比优选为2:3:5，此外还可包含甲醇、异戊醇等成分；洗脱液是TE溶液，优选为10mMTris-HCl、1mMEDTA，pH＝8.0；磁珠是经过表面修饰的(羟基、羧基等修饰)四氧化三铁；作为优选，所述特异性核酸片段富集试剂盒为甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒、亚硫酸氢盐转化试剂盒或甲基化限制性内切酶试剂盒。其中，所述甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒包括IgG阴性抗体、5-mC阳性抗体、蛋白酶K、核酸纯化柱、IP缓冲液、TE缓冲液、磁珠、DNA结合液和DNA洗脱液。所述甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒可直接采用市售商用试剂盒，如CST生产的SimpleDIPHydroxy/MethylatedDNAIP(hMeDIP)Kit，货号是#95176&#76853，也可采用Abcam、Epigenetic等品牌的同类试剂盒；作为优选，所述数字PCR检测试剂包括数字PCR反应芯片、PCR预混液、阳性质控品、阴性质控品、ddH2O，以及各目的基因和各参比基因对应的引物探针对。其中，数字PCR反应芯片为硅片，经过激光刻蚀，在硅片上形成2万个左右的微反应单元；PCR预混液为可满足数字PCR反应的所有成分，包括酶类如Taq酶，反应缓冲液如Mg离子、Tris溶液等；数字PCR检测试剂质控品为确定拷贝数的任何DNA片段，用来质控数字PCR试剂是否正常；阴性质控品为无核酸成分的ddH2O；本专利技术所述与染色体非整数倍相关的染色体为人21号染色体、18号染色体或13号染色体；在具体实施方式中，与染色体非整数倍相关的染色体为人21号染色体，所述目的基因为人21号染色体上具备甲基化差异的核酸片段或其上/下游500bp片段，所述核酸片段具体如下：chr21:38497656-38497711(简称为靶基因-21-1或目的基因-21-1)，chr21:38497859-38497916(简称为靶基因-21-2或目的基因-21-2)，chr21:38986034-38986094(简称为目的基因-A1)，chr21:38986082-38986150(简称为目的基因-A2)，chr21:38985737-38985791(简称为目的基因-A3)，chr21:38985941-38986007(简称为目的基因-A4)，chr21:43916782-43916835(简称为目的基因-B1)，chr21:43916281-43916342(简称为目的基因-B2)，chr2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒，其特征在于，包括母体血浆游离核酸提取试剂、特异性核酸片段富集试剂盒、数字PCR检测试剂和贡献系数表；其中，所述贡献系数表由以下方式获得：步骤1、确定与染色体非整数倍相关的染色体上具备甲基化差异的核酸片段为目的基因，选取与染色体非整数倍无关的染色体上的任意核酸片段为参比基因；步骤2、以正常染色体倍数的胎儿绒毛或新生儿血液为样本提取DNA，设计上述各目的基因和参比基因的引物探针对，通过数字PCR检测获得各目的基因和参比基因的拷贝数；步骤3、从目的基因中选择一个或两个以上做为靶基因，将所选择的目的基因的平均拷贝数记为所述靶基因的拷贝数，将各目的基因的拷贝数和各参比基因拷贝数分别与所述靶基因的拷贝数相比，所得系数为剩余的各目的基因和各参比基因的贡献系数；步骤4、重复步骤2和步骤3多次，选择每次所获得的贡献系数误差在±0.2内的目的基因和参比基因为实际检测时的使用基因，其任意一次获得的贡献系数或多次所获得的贡献系数的平均值组成贡献系数表。

【技术特征摘要】
1.一种检测胎儿染色体非整数倍的试剂盒，其特征在于，包括母体血浆游离核酸提取试剂、特异性核酸片段富集试剂盒、数字PCR检测试剂和贡献系数表；其中，所述贡献系数表由以下方式获得：步骤1、确定与染色体非整数倍相关的染色体上具备甲基化差异的核酸片段为目的基因，选取与染色体非整数倍无关的染色体上的任意核酸片段为参比基因；步骤2、以正常染色体倍数的胎儿绒毛或新生儿血液为样本提取DNA，设计上述各目的基因和参比基因的引物探针对，通过数字PCR检测获得各目的基因和参比基因的拷贝数；步骤3、从目的基因中选择一个或两个以上做为靶基因，将所选择的目的基因的平均拷贝数记为所述靶基因的拷贝数，将各目的基因的拷贝数和各参比基因拷贝数分别与所述靶基因的拷贝数相比，所得系数为剩余的各目的基因和各参比基因的贡献系数；步骤4、重复步骤2和步骤3多次，选择每次所获得的贡献系数误差在±0.2内的目的基因和参比基因为实际检测时的使用基因，其任意一次获得的贡献系数或多次所获得的贡献系数的平均值组成贡献系数表。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述母体血浆游离核酸提取试剂包括裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠和蛋白酶K。3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述特异性核酸片段富集试剂盒为甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒、亚硫酸氢盐转化试剂盒或甲基化限制性内切酶试剂盒。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述甲基化DNA免疫共沉淀试剂盒包括IgG阴性抗体、5-mC阳性抗体、蛋白酶K、核酸纯化柱、IP缓冲液、TE缓冲液、磁珠、DNA结合液和DNA洗脱液。5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述数字PCR检测试剂包括数字PCR反应芯片、PCR预混液、数字PCR检测试剂质控品、阴性质控品、ddH2O，以及各目的基因和各参比基因对应的引物探针对。6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述与染色体非整数倍相关的染色体为人21号染色体、18号染色体或13号染色体。7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述目的基因为人21号染色体上具备甲基化差异的核酸片段或其上/下游500bp片段，所述核酸片段具体如下：chr21:38497656-38497711，chr21:38497859-38497916，chr21:38986034-38986094，chr21:38986082-38986150，chr21:38985737-38985791，chr21:38985941-38986007，chr21:43916782-43916835，chr21:43916281-43916342，chr21:43916347-43916411，chr21:43917131-43917225，chr21:43916957-43917016，chr21:43916929-43916991，chr21:33026413-33026470，chr21:33026045-33026103，chr21:33026678-33026739，chr21:33026524-33026578，chr21:33025968-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱留伟，
申请(专利权)人：领航基因科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33