一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：小反刍兽疫病毒V基因原核表达载体构建pGEX–4T–V；重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE和western–blot鉴定；pGEX–4T–V蛋白纯化和浓度测定；重组pGEX–4T–V蛋白免疫小鼠制备单抗；单抗腹水的制备；小反刍兽疫V基因一个片段（已知序列）的多肽合成制备单抗；真核表达小反刍兽疫V蛋白；三株单抗间接免疫荧光和抗体分型试验等。本发明专利技术为小反刍兽疫基因工程疫苗的诊断奠定可靠的技术保障和支撑。

Prokaryotic and Eukaryotic Expression, Purification and Preparation of Monoclonal Antibody of Pestilence of Small Ruminants V Protein

The invention discloses a method for prokaryotic and eukaryotic expression, purification and monoclonal antibody preparation of pestilence petits ruminant virus V protein, including the following steps: construction of prokaryotic expression vector of pestilence petits ruminant virus V gene to construct pGEX-4T-V; identification of recombinant pGEX-4T-V protein SDS-PAGE and western-blot; purification and concentration determination of pGEX-4T-V protein; immunization of mice with recombinant pGEX-4T-V protein to prepare monoclonal antibodies; The preparation of ascites of monoclonal antibodies; the synthesis of monoclonal antibodies from polypeptide of a fragment (known sequence) of small ruminant disease V gene; the expression of small ruminant disease V protein in eukaryotic cells; the indirect immunofluorescence and antibody typing tests of three monoclonal antibodies, etc. The invention lays a reliable technical guarantee and support for the diagnosis of genetically engineered vaccine against pestilence of small ruminants.

【技术实现步骤摘要】
一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法。
技术介绍
小反刍兽疫(PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征的急性、高度接触性传染病，给畜牧养殖业造成严重的经济损失。OIE将该病列为A类烈性传染病，我国将其列为Ⅰ类动物疫病。2007年7月，我国西藏阿里首次暴发了PPR。中国农业部立即公布了预防和控制PPR国家技术规范、预防和控制PPR应急计划，并从2008年在全国实施PPR监控策略。我国目前采取弱毒疫苗(Nigera75/1)接种预防PPR，该疫苗免疫效果较好，但由于带毒与排毒给疾病的诊断及检测带来困难。活疫苗诱导机体，与病毒灭活疫苗相比，有高的和潜在的毒力返强现象，全病毒灭活疫苗将是一个更安全的替代品。当前还没有商品化的PPR灭活苗、痘载体疫苗等，也没有关于PPRV蛋白单抗制备的相关研究，但PPR疫苗研究趋向于基因工程苗和灭活苗。应用现有RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒总RNA中扩增V基因片段924bp(代HA标签)，克隆至pGEX-4T-1载体中，原核表达PPRV蛋白，纯化蛋白，制备了V蛋白单抗，为PPR的诊断与预防提供技术支撑。现有技术中，还没有关于一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法。其具体技术方案为：一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，包括以下步骤：(一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp。应用DNAStar软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点。上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI。下游引物加HA标签，HA序列为：TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT，HA标签反转录序列：AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA。根据Oligo7软件设计V基因引物，上游引物P1：AACCGAATTCATGGCAGAAGAACAAGCATACCAT；下游引物加HA标签如下，P2：ATTTCCCGGGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGCTGAGTCAGTGATGC。突变引物M1：突变引物M2：方框里的碱基是V基因的突变点。引物由上海生物工程有限公司合成。(二)Nigera75/1疫苗毒(本实验室保存)RNA的提取：TRIzolLS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶。1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液250ul，再加入TRIzolLS750ul，充分混匀，室温放置5min；2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)，室温放置3min(由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心)；3、4℃，12000r/min离心15min，取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)；4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；5、4℃，12000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清；6、加1ml75％乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在室温干燥5min；7、加入25ulDEPC处理水，立即进行PT–PCR扩增。(三)RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因以提取的2.5uLRNA溶液做模板，按照宝生物公司的RT–PCR试剂盒进行加样，应用P1和M2、P2和M1为引物进行RT-PCR扩增。反应体系：2×Buffer25uL，上下游引物各1uL，RNA模板2.5uL，酶1uL，水19.5uL，总体系50uL。反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行RT-PCR产物分析。P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；P2和M1引物扩增的片段大小为220bp，命名为N2。(四)融合PCR扩增以P1和P2为引物，N1和N2为模板进行PCR扩增。反应体系：10×Buffer5uL，上下游引物各1uL，模板N1和N2各0.35uL，ExTaq酶0.3uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。目的片段V基因大小924bp。(五)PCR产物胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因。(六)分别单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒SmaI30℃过夜酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒(实验室保存)，回收纯化后应用EcoRI37℃单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒。(七)双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化上述(六)V基因和pGEX–4T–1载体质粒，–20℃保存备用。(八)V基因和pGEX–4T–1载体的连接和转化(DH5α中)。1、双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒进行连接(16℃过夜)和转化。2、连接产物转化。全部的连接产物和0.5uLpGEX–4T–1载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自天根公司)过4μL)中；冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；加900uL无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50-100uL涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。大肠杆菌DH5α/pGEX–4T–1(EscherichiacoliDH5α/pGEX–4T–1)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2018400，保藏日期为2018年6月26日。保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。(九)重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定(DH5α中)1、重组质粒pGEX–4T–V的提取挑取琼脂板里的7个单菌落接种到含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基里，37℃过夜摇菌。第二天提取质粒，按照上海生物工程有限公司的质粒抽提试剂盒说明进行重组质粒pGEX–4T–V的提取。重组质粒琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定1和2泳道为阳性重组质粒，分别命名质粒1和质粒2。下一步进行PCR和双酶切鉴定。2、重组质粒pGEX–4T–VPCR鉴定PCR反应体系：10×Buffer5uL，P1和P2上下游引物各1uL，模板0.5uL，ExTaq酶0.5uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL。反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析。我们选取质粒1和质粒2进行扩增，V基因片段大小约900bp左右，扩增正确；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp；应用DNAStar软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点；上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI；下游引物加HA标签，HA序列如SEQ:ID:NO:1所示，HA标签反转录序列如SEQ:ID:NO:2所示；根据Oligo 7软件设计V基因引物，上游引物P1：如SEQ:ID:NO:3所示；下游引物加HA如SEQ:ID:NO:4所示，,突变引物M1如SEQ:ID:NO:5所示，突变引物M2如SEQ:ID:NO:6所示；(二)Nigera75/1疫苗毒RNA的提取：TRIzol LS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶；1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液250ul，再加入TRIzol LS 750ul，充分混匀，室温放置5min；2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象，室温放置3min；3、4℃，12000r/min离心15min，取上层液相移入另一管)；4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；5、4℃，12000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清；6、加1ml75％乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在室温干燥5min；7、加入25ul DEPC处理水，立即进行PT–PCR扩增；(三)RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因以提取的2.5uLRNA溶液做模板，按照宝生物公司的RT–PCR试剂盒进行加样，应用P1和M2、P2和M1为引物进行RT‑PCR扩增；反应体系：2×Buffer 25uL，上下游引物各1uL，RNA模板2.5uL，酶1uL，水19.5uL，总体系50uL；反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行RT‑PCR产物分析；P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；P2和M1引物扩增的片段大小为220bp，命名为N2；(四)融合PCR扩增以P1和P2为引物，N1和N2为模板进行PCR扩增；反应体系：10×Buffer 5uL，上下游引物各1uL，模板N1和N2各0.35uL，Ex Taq酶0.3uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL；反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析；目的片段V基因大小924bp；(五)PCR产物胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因；(六)分别单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒SmaI 30℃过夜酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒，回收纯化后应用EcoRI37℃单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒；(七)双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化上述(六)V基因和pGEX–4T–1载体质粒，–20℃保存备用；(八)V基因和pGEX–4T–1载体的连接和转化1、双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒进行连接和转化；2、连接产物转化；全部的连接产物和0.5uL pGEX–4T–1载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞DH5α过4μL)中；冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；加900uL无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50‑100uL涂在含有氨苄青霉素100μg/mL的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；(九)重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定(十)载体质粒pGEX–4T–1和阳性重组质粒pGEX–4T–V转化到表达的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中转化、挑菌、质粒提取如前(八)和(九)所述的具体的方法；(十一)重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE鉴定将阳性重组菌按照1％接种到5mL含氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基里，37℃、250rpm/min摇菌过夜；第二天保存菌种到50％的甘油里，按照2％接种到10mL LB液体培养基，摇菌2个小时测菌液OD值在0.6～0.8之间加1mM/mLIPTG诱导表达蛋白，加诱导剂之前取1mL菌液做阴性对照；诱导表达4小时后，取菌液到10mL离心管里，离心弃掉上清，用PBS洗涤一次；用2mL的PBS溶解，超声破碎，超声4s，间隔5s，超声25次；...

【技术特征摘要】
1.一种小反刍兽疫V蛋白原核和真核表达、纯化和单抗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)Nigera75/1疫苗毒V基因的引物设计：根据NCBI序列号码：X74443下载V基因序列，897bp；应用DNAStar软件分析，设计上游和下游引物序列的酶切位点；上游酶切位点为EcoRI，下游酶切位点为SmaI；下游引物加HA标签，HA序列如SEQ:ID:NO:1所示，HA标签反转录序列如SEQ:ID:NO:2所示；根据Oligo7软件设计V基因引物，上游引物P1：如SEQ:ID:NO:3所示；下游引物加HA如SEQ:ID:NO:4所示，,突变引物M1如SEQ:ID:NO:5所示，突变引物M2如SEQ:ID:NO:6所示；(二)Nigera75/1疫苗毒RNA的提取：TRIzolLS提取法：提取物为细胞培养液毒，提取时所用一切物品均无RNA酶；1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液250ul，再加入TRIzolLS750ul，充分混匀，室温放置5min；2、加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象，室温放置3min；3、4℃，12000r/min离心15min，取上层液相移入另一管)；4、加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；5、4℃，12000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清；6、加1ml75％乙醇洗一遍，4℃，8000r/min离心10min，用枪小心吸去所有上清，在室温干燥5min；7、加入25ulDEPC处理水，立即进行PT–PCR扩增；(三)RT–PCR扩增Nigera75/1疫苗毒V基因以提取的2.5uLRNA溶液做模板，按照宝生物公司的RT–PCR试剂盒进行加样，应用P1和M2、P2和M1为引物进行RT-PCR扩增；反应体系：2×Buffer25uL，上下游引物各1uL，RNA模板2.5uL，酶1uL，水19.5uL，总体系50uL；反应程序为：50℃30min，94℃2min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行RT-PCR产物分析；P1和M2引物扩增的片段大小为705bp，命名为N1；P2和M1引物扩增的片段大小为220bp，命名为N2；(四)融合PCR扩增以P1和P2为引物，N1和N2为模板进行PCR扩增；反应体系：10×Buffer5uL，上下游引物各1uL，模板N1和N2各0.35uL，ExTaq酶0.3uL，dNTP4uL，水38uL，总体系50uL；反应程序为：94℃5min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析；目的片段V基因大小924bp；(五)PCR产物胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化PCR扩增的V基因；(六)分别单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒SmaI30℃过夜酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒，回收纯化后应用EcoRI37℃单酶切V基因和pGEX–4T–1载体质粒；(七)双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒胶回收和纯化应用上海生物工程有限公司的胶回收纯化试剂盒，回收和纯化上述(六)V基因和pGEX–4T–1载体质粒，–20℃保存备用；(八)V基因和pGEX–4T–1载体的连接和转化1、双酶切后的V基因和pGEX–4T–1载体质粒进行连接和转化；2、连接产物转化；全部的连接产物和0.5uLpGEX–4T–1载体质粒分别加入到50uL大肠杆菌感受态细胞DH5α过4μL)中；冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴2min；加900uL无抗性LB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养60min；离心后取50-100uL涂在含有氨苄青霉素100μg/mL的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；(九)重组质粒pGEX–4T–V的提取和鉴定(十)载体质粒pGEX–4T–1和阳性重组质粒pGEX–4T–V转化到表达的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中转化、挑菌、质粒提取如前(八)和(九)所述的具体的方法；(十一)重组pGEX–4T–V蛋白SDS–PAGE鉴定将阳性重组菌按照1％接种到5mL含氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基里，37℃、250rpm/min摇菌过夜；第二天保存菌种到50％的甘油里，按照2％接种到10mLLB液体培养基，摇菌2个小时测菌液OD值在0.6～0.8之间加1mM/mLIPTG诱导表达蛋白，加诱导剂之前取1mL菌液做阴性对照；诱导表达4小时后，取菌液到10mL离心管里，离心弃掉上清，用PBS洗涤一次；用2mL的PBS溶解，超声破碎，超声4s，间隔5s，超声25次；12000rpm/min离心10min，分装上清和用500uLPBS溶解沉淀；取诱导后沉淀和上清各60ul溶解在4倍的上样缓冲液中，同时取诱导后的载体沉淀和上清做阴性对照，沸水中煮沸5min，上样10ul进行SDS–PAGE；(十二)western–blot鉴定SDS–PAGE之后1块胶进行转膜，使用PVDF膜，转移液提前2小时放入到–20℃保存备用；取出来的胶用去离子水冲洗，放入到转移液里；剪比蛋白胶大一点的滤纸6层，放入到转移液中；浸泡黑色的海绵到转移液里，再放到转膜曹里；浸泡的滤纸放到海绵上；蛋白胶放在滤纸上，浸泡在甲醇里膜放在胶上；浸泡的另外3层滤纸放在膜上；赶走多余的气泡，放入浸泡过的黑海绵；整体夹紧放入转膜曹里，倒入转移液和放冰袋，100V1小时；拿出转移好的膜，PBST洗涤3次，每次3min；用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；PBST洗涤3次，加抗HA标签的单抗1:150，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，加抗鼠的二抗1:2500，室温摇床孵育2小时；PBST洗涤3次，显色；显色液配方：1ml去离子水，0.01克氯化镍，9ml20mMpH7.6的This-HCl，0.006克DAB，10ul30％双氧水；显色后晾干观察结果；(十三)pGEX–4T–V蛋白纯化诱导表达300mlpGEX–4T–V重组菌；离心，沉淀用PBS洗涤1次；用6mlPBS溶解沉淀，超声4s，间隔5s，超声30次；12000rpm/min离心15min，上清2ml/管分装到EP管里；使用GE公司的GST重力柱按照说明书的步骤进行纯化表达的蛋白为免疫小鼠做准备；(十四)纯化的蛋白浓度测定应用上海生物工程有限公司的BCA法蛋白质浓度测定试剂盒，测定纯化的蛋白浓度，然后免疫Balb/c小鼠；(十五)小鼠免疫纯化的蛋白3.00mg/mL，以0.1mg/mL与弗氏完全佐剂等体积混匀，选择7周龄Balb/c雌性小鼠，腹腔注射0.2mL；分别在第14、28d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原加强免疫，在第42d断尾采血，分离血清；用间接ELISA方法进行抗体水平检测，对免疫效果较好及抗体效价测定较高的小鼠腹腔注射0.1mL蛋白，第45d无菌取小鼠脾细胞进行融合；(十六)Nigero75/1病毒的制备Vero细胞由本实验室保存；扩大培养的Vero细胞在225cm2细胞瓶里进行传代，同步按照2％接Nigero75/1病毒，37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；每天观察细胞状态，第三天细胞病变明显，反复冻融三次后﹣20℃保存，进行病毒浓缩；500ml的毒液10000rpm离心30min去除细胞碎片；用100KD超滤浓缩离心管6000rpm离心15min；吸取V型管内液体，将离心管内的液体弃之；反复离心多次，最终浓缩的病毒液100ml；将浓缩的毒液分装到2ml离心管内，﹣70℃冻存备用；(十七)间接ELISA单抗筛选检测方法的建立按常规间接ELISA操作步骤，采用方阵法确定抗原最佳包被浓度、抗体的最佳工作浓度及叛定标准；根据阳性血清孔的OD值接近1.0，阴性血清OD值<0.2，P/N>2.1为阳性，同时设立空白对照及SP2/0上清对照；纯化的Nigero75/1病毒作为抗原包被，采用方阵试验进行测定：病毒用包被液做1:1、1:2、1:4、1:8稀释，加入酶标板，100μL/孔，并轻弹或振动平板以使抗原分布均匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆桂丽，黄炯，苗书魁，马文戈，王杰，沙依兰·卡伊扎，王延，刘丽娅，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆,65