本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及超量表达转录因子SlBBX20提高番茄花青素的含量。本发明专利技术克隆到一个控制番茄叶片花青素合成的关键基因SlBBX20，对其进行了生物学功能鉴定。该基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所示。通过转基因功能验证表明，在番茄中超量表达该基因，可以显著调节番茄叶片花青素含量的功能。
Overexpression of Transcription Factor SlBBX20 Enhances Anthocyanin Content in Tomato
The invention belongs to the field of plant genetic engineering technology. Specifically, the over-expression of transcription factor SlBBX20 increased the content of anthocyanin in tomato. The present invention clones a key gene SlBBX20 which controls anthocyanin synthesis in tomato leaves and carries out biological function identification. The sequence of the gene is shown in the sequence table SEQ ID NO:1 and the sequence of the protein encoded by the gene is shown in SEQ ID NO:3. The results of functional verification showed that overexpression of the gene in tomato could significantly regulate the function of anthocyanin content in tomato leaves.
【技术实现步骤摘要】
超量表达转录因子SlBBX20提高番茄花青素的含量
本专利技术属于植物基因工程领域。具体涉及超量表达转录因子SlBBX20提高番茄花青素的含量。本专利技术利用反向遗传学的方法，分离克隆了一个具有提高番茄花青素的含量的功能基因SlBBX20，将该基因在番茄中超量表达，能够显著提高番茄叶片花青素合成与积累。利用本专利技术可以有效提高番茄叶片中花青素的含量。
技术介绍
花青素(Anthocyanin)，又称为花色素，是黄酮类化合物中最主要的组成部分，主要赋予植物果实、叶片、花等组织器官以各种各样的颜色，是一种水溶色素。花青素作为植物次生代谢的重要产物，参与多种多样的生物进程。当植物受到外界环境胁迫，如光照、低温、盐胁迫、氧化胁迫、蔗糖及大量营养元素缺失等，都能诱导花青素的表达以提高植物对外界环境的适应能力。类黄酮化合物形成的起始底物为苯丙氨酸，这一类化合物主要包括花青素、黄酮醇以及原花青素3种(Winkel-Shirley,2001)。近几年，对于类黄酮的研究主要着眼于对人类健康方面的潜在功能，比如抗氧化、抗衰老、抗心血管疾病及抗癌等(Yaoetal,2004)。因此，进一步探讨花青素的合成、调控及生物学功能具有重要的意义。目前，花青素生物合成途径及其关键酶的研究已经相当清楚(Martensetal2010；Wangetal2013)，对花青素合成途径相关转录因子的研究也取得了较大进展，主要受四种转录因子家族的调控，分别是MYB、bHLH、WD40-repeat以及bZIP。在拟南芥、玉米、矮牵牛、葡萄、金鱼草、苹果、紫苏、草莓、非洲菊、杨梅等植物中均分离和鉴定出一些花青素合成相关的调控因子。研究表明，在拟南芥花青素合成途径中，MYB转录因子家族基因与bHLH转录因子家族基因及WD40蛋白家族互作，形成一个MYB-bHLH-WD40(MBW)复合体，从而调控花青素的合成，在对其他植物，如：草莓、苹果、葡萄、杨梅等的研究中也发现了类似的调控模式(Anetal2012；Gonzalezetal2008；Outchkourovetal2014；RamsayandGlover2005；Schaartetal2013)。MYB转录因子家族主要参与苯丙烷代谢途径的调控，其中主要是R2R3-MYB亚家族。对R2R3-MYB(PAP1、PAP2)研究发现R2R3-MYB激活了花青素合成途径上的结构基因，同时苯丙烷代谢途径的起始基因苯丙氨酸裂解酶基因(PAL1、PAL2)也被激活，进而促进花色素的积累(Borevitzetal，2000)。R3-MYB蛋白家族中，MYBL2被认为是花青素合成途径上的一个抑制子(Matsuietal2008)。有研究表明，在强光照条件下，MYBL2的表达水平明显降低，进而导致花青素大量积累(Rowanetal2009)。拟南芥中参与调控花青素合成的bHLH家族基因主要有：TT8、EGL3、GL3等,当异位表达EGL3、GL3和TT8时发现三者之间存在功能冗余，在蛋白互作方面可以相互替代(Zhangetal2003)。在花青素合成生物途径中，WD40并没有很显著的催化特性，TTG1是这一家族的一个重要的与花青素合成相关的转录因子，主要与bHLH和MYB家族的相关转录因子形成一个复合体，进而激活花青素合成途径(Chattopadhyayetal1998)。bZIP家族转录因子中HY5，HYH是参与花青素合成途径的两个重要转录因子。HY5(elongatedhypocotyl5)，是下游光敏色素、隐花色素，UV-B光感受器的一个组件，参与花青素合成途径(Vandenbusscheetal2014)。HY5是对光信号响应的一个重要转录因子，并且通过影响下游基因的表达进而调控光形态建成(Chattopadhyayetal1998)。因此，HY5在协调光信号及关键基因表达方面起到了一个重要的调节作用(Leeetal2007)。HY5调控花青素合成的机理主要是通过与早期表达基因及后期表达基因(如CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR及LDOX等)的启动子结合进而调控此途径上的结构基因的表达(Zhangetal2011)。在番茄中，对花青素积累及调控的研究相对较少，有些研究是通过导入异源物种基因来调控花青素(Butellietal2008)。番茄中研究鉴定的与花青素相关的调控因子主要有两个，LeANT1和LeAN2，均为R2R3-MYB型转录因子(Mathews2003；PetroniandTonelli2011；Sapiretal2008)。而在对众多植物的研究中发现的锌指蛋白类转录因子能够调控花青素的积累未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，分离、克隆了一个植物花青素合成的调控基因，被命名为SlBBX20基因，通过在番茄中超量表达SlBBX20基因，能够显著提高番茄花青素的合成与积累，经基因改良后的番茄叶片由绿色变为深紫色。针对这样的结果，申请人推测如果能够充分开发与利用，从番茄叶片中提取天然抗氧化物质花青素，将可能产生较好的经济效益。申请人发现并鉴定了首个锌指蛋白类转录因子能够调控花青素的积累，超量表达该转录因子后能够强烈调控番茄叶片花青素合成与积累。本专利技术的SlBBX20基因是能够调控番茄叶片花青素积累的一个新的转录因子，目前未见有该基因功能的报道。申请人从番茄材料中克隆到该基因的序列，该基因在GenBank核苷酸数据库中登录号为XM_004231383.2预测为SolanumlycopersicumB-boxzincfingerprotein20(LOC101247171),transcriptvariantX2,mRNA。SolGenomicsNetwork上预测为ZincfingerproteinCONSTANS-LIKE1。分析其保守域发现含有两个bBOX结构域，基因注释为锌指蛋白20，因此申请人根据该类基因的命名规则，将该基因命名为SlBBX20基因。本专利技术是这样实现的：本专利技术在对利用全基因组关联技术获得的大量候选基因进行功能鉴定时，发现在番茄中超量表达SlBBX20转录因子后，番茄叶片中的花青素显著积累。该基因在GenBank中预测的信息为:SolanumlycopersicumB-boxzincfingerprotein20(LOC101247171),transcriptvariantX2,mRNA(ACCESSION：XM_004231383，GI:723666003)。SolGenomicsNetwork中预测为ZincfingerproteinCONSTANS-LIKE1，其cDNA序列如序列表SEQIDNO：1所示，该cDNA全长835bp，ORF序列178-789bp，共612bp。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，共编码203个氨基酸，将该基因在番茄中超量表达，可以显著提高番茄叶片中花青素的合成与积累。本专利技术所述的植物包括单子叶植物、双子叶植物。本专利技术将鉴定克隆的基因命名为SlBBX20，包括该基因的DNA序列、cDNA序列，与该序列具有高度同源性的序列及编码相同功能蛋白质的DNA序列，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述基因包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种超量表达转录因子SlBBX20基因在提高番茄花青素的含量中的应用，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种超量表达转录因子SlBBX20基因在提高番茄花青素的含量中的应用，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQIDNO：1...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶志彪，王涛涛，林爱华，张春丽，罗丹，李汉霞，张俊红，熊程，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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