枫香拟茎点霉菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种枫香拟茎点霉菌NUSTb1，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2018476，其ITS基因序列如SEQ ID NO：1所示。该菌株可用于制备水溶性胞外多糖，制备所得水溶性胞外多糖能够促进铜绿假单胞菌生物被膜的合成，有益于提高铜绿假单胞菌的耐药能力，适用于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Phytophthora formosana and its application

The invention discloses a Liquidambar pseudorhizomatous fungus NUSTb1, whose storage number is CCTCC NO: M 2018476, and ITS gene sequence is shown as SEQ ID NO: 1. The strain can be used to prepare water-soluble extracellular polysaccharides. The prepared water-soluble extracellular polysaccharides can promote the synthesis of Pseudomonas aeruginosa biofilm, improve the drug resistance of Pseudomonas aeruginosa, and be suitable for industrial production. It has good development and application prospects.

【技术实现步骤摘要】
枫香拟茎点霉菌及其应用
本专利技术属于微生物技术，特别是涉及一种枫香拟茎点霉菌及其应用。
技术介绍
细菌被膜是由细菌黏附在细菌接触物体表面上，合成分泌多糖、纤维蛋白和脂质蛋白基质等物体，同时将菌体自身包埋其中的一种膜状物[1，2]。生物被膜是细菌的一种保护性生长方式，用来适应外界的不利影响，能使细菌对抗生素的耐药性增强10-1000倍[3]。该膜是细菌的三维聚合体，抗菌药物难以透过，导致细菌高度耐药性，使其能长期存活，不易清除，引起慢性和难治疗性感染疾病的反复发作，给临床抗感染治疗带来极大地困难。铜绿假单胞菌是医院获得性感染的重要条件致病菌和耐药菌之一，在感染的机体中常以生物被膜的形式存在。现有的研究都是发现对生物被膜破坏的物质，对生物被膜具有促进作用的物质很少。参考文献：[1]LasaI.Towardstheidentificationofthecommonfeaturesofbacterialbiofilmdevelopment.IntMicrobiol.2006；9(1):21-28[2]DonlanRM,CostertonJW.Biofilms:survivalmechanismsofclinicallyrelevantmicro-oranganisms.ClinMicrobiolRev.2002；15(2)67-93.[3]MahTFC,O,TooleGA.Mechanismsofbiofilmesistancetoantimicrobialagents[J].Trendsinmicrobiology[J],2001,9(1):34-39专利技术内容专利技术目的：本专利技术提供了一种枫香拟茎点霉属新菌株，该菌种能够用于制备促进生物被膜合成的水溶性胞外多糖。技术方案：本专利技术所述的一种枫香拟茎点霉菌，其分类命名为枫香拟茎点霉菌(PhomopsisLiquidambari)NUSTb1，保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国武汉，其保藏编号为：CCTCCNO：M2018476，保藏日期为2018年7月13日。所述枫香拟茎点霉菌NUSTb1的ITS基因序列如SEQIDNO：1所示。上述枫香拟茎点霉菌NUSTb1在制备水溶性胞外多糖中的应用也本专利技术保护范围内，其中，所述水溶性胞外多糖结构式为：[→4)-α-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-Glc-(1→4))-α-Glc-(1→]n。利用本申请枫香拟茎点霉菌制备水溶性胞外多糖的方法，包括以下步骤：(1)活化：将菌株NUSTb1在固体PDA培养基上活化；(2)发酵：刮取步骤(1)活化后长在固体PDA培养基上的菌体，接种至pH6.3-6.4液体发酵培养基中，28-30℃，180-200rpm，培养10-15天；(3)多糖的分离和纯化：将步骤(2)得到的发酵液离心，收集上清液并添加沉淀剂，常温静置过夜后离心取沉淀干燥，然后用去离子水配成1％溶液，离心，上清液中加入sevage溶液，剧烈震荡半小时，静置至完全分层，去掉下层有机相和中间蛋白层，再加入sevage溶液，重复上述步骤，直至中间无蛋白层，得到去蛋白的多糖液：45-55℃旋蒸浓缩，然后采用7-14KDa-的透析袋用去离子水透析1-2d，每4-8h换水一次，透析液冻干得粗多糖；粗多糖再经葡聚糖凝胶柱分离纯化得到纯多糖。其中，步骤(1)中，所述固体PDA培养基为：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，PH5.4-5.8，水1L，121℃15分钟灭菌所得。步骤(2)中，所述液体发酵培养基包括以下重量份数的各个组分：甘露醇20g，麦芽糖20g，谷氨酰胺10g，磷酸二氢钾0.5g，葡萄糖10g，硫酸镁0.3g，色氨酸0.5g，酵母浸膏3g，水1L；混合均匀后115℃灭菌15min，冷却得到液体发酵培养基。步骤(3)中，所述沉淀剂为工业95％乙醇或甲醇或丙酮。收集上清液并添加沉淀剂，是指收集上清液并添加其3-4倍体积的工业95％乙醇或甲醇或丙酮。步骤(3)中，所述离心取沉淀干燥是指在60℃下烘干或者冷冻干燥；所述sevage溶液加入量为上清液体积的三分之一或四分之一。步骤(3)中，所述葡聚糖凝胶柱为sephadexG100或sephadexG200。根据方法制备所得多糖也在本专利技术保护范围内，所述多糖结构式为：[→4)-α-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-Glc-(1→4))-α-Glc-(1→]n。上述多糖的应用也在本专利技术保护范围内，所述应用为：促进铜绿假单胞菌PAO1生物被膜的合成。所述多糖通过促进铜绿假单胞菌PAO1生物被膜的合成，从而提高其耐药性。有益效果：本专利技术从石榴叶子中筛选得到一种枫香拟茎点霉属新菌株，通过枫香拟茎点霉属内生真菌制备得到的水溶性胞外多糖，能够促进铜绿假单胞菌生物被膜的合成，有益于提高铜绿假单胞菌的耐药能力，适用于工业化生产，具有良好的开发应用前景。生物材料的保藏枫香拟茎点霉菌(PhomopsisLiquidambari)NUSTb1，保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为：CCTCCNO：M2018476，保藏日期为2018年7月13日。附图说明图1是实施例3所得胞外多糖组成的高效液相色谱图；图2是实施例3所得多糖的核磁谱图；图3是实施例4多糖对铜绿假单胞菌被膜的促进结果示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。材料准备：石榴叶子：石榴科石榴属，取自南京理工大学东园小区。铜绿假单胞菌PAO1由中国海洋大学宫倩红教授惠赠。实施例1菌株筛选和纯化菌株筛选：将采摘的石榴叶子用酒精擦拭表面，无菌水洗涤后用无菌剪刀剪碎放入已灭菌的磷酸盐缓冲液中，超声震荡，吸取1ml加入到9mL无菌水中，混匀制成菌悬浮液，采用10倍梯度稀释，取10-7-10-4稀释度的菌悬液涂布于察氏培养基，28℃下培养。其中，察氏培养基：NaNO33g，K2HPO41g，MgSO40.5g，KcL0.5g，FeSO40.01g，蔗糖30g，琼脂15g，水1L，PH7.1-7.5，121℃20分钟灭菌所得。菌株纯化：涂布的平板培养7天，待长出菌落后，根据菌落形态特征挑取单一菌落在新的固体培养基上划线，28℃下培养，待长出菌落后再挑选单一菌落划线，此过程重复3-5次，直至培养基上长出的菌落为单一形态的菌落使得菌株纯化完全。挑选上述纯化的产胞外多糖特征的菌落，接种至液体发酵培养基中，28℃，180rpm条件下培养15天，若发酵液变粘，则鉴定胞外发酵物是否是多糖。经鉴定后发酵产物为多糖的菌株是需要的产胞外多糖菌株，命名为NUSTb1。实施例2菌株的鉴定A、形态特征：在固体PDA培养基上28℃培养菌株7天后观察，菌落白色，绒状平铺不规则，呈放射状。B、以菌株的基因组DNA为模板，以核糖体内转录间隔区ITS1和ITS2区基因的PCR扩增的通用引物ITS1和ITS4为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，该菌株的ITS基因序列如SEQIDNO：1所示，具体如下：CTGCGGAGGGATCATTGCTGGAACGCGCCCCAGGCGCACCCAGAAACCCTTTGTGAACTTATACCTTACTGTTGCCTCGGCGCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.枫香拟茎点霉菌NUSTb1，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2018476。

【技术特征摘要】
1.枫香拟茎点霉菌NUSTb1，其保藏编号为：CCTCCNO：M2018476。2.权利要求1所述枫香拟茎点霉菌NUSTb1的ITS基因序列如SEQIDNO：1所示。3.权利要求1或2所述枫香拟茎点霉菌NUSTb1在制备水溶性胞外多糖中的应用，所述水溶性胞外多糖结构式为：[→4)-α-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-Glc-(1→4))-α-Glc-(1→]n。4.一种利用权利要求1或2所述枫香拟茎点霉菌制备水溶性胞外多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)活化：将菌株NUSTb1在固体PDA培养基上活化；(2)发酵：刮取步骤(1)活化后长在固体PDA培养基上的菌体，接种至pH6.3-6.4液体发酵培养基中，28-30℃，180-200rpm，培养10-15天；(3)多糖的分离和纯化：将步骤(2)得到的发酵液离心，收集上清液并添加沉淀剂，常温静置过夜后离心取沉淀干燥至无水，然后用去离子水配成1％溶液，离心，上清液中加入sevage溶液，剧烈震荡半小时，静置至完全分层，去掉下层有机相和中间蛋白层，再加入sevage溶液，重复上述步骤，直至中间无蛋白层，得到去蛋白的多糖液：45-55℃旋蒸浓缩，然后采用7-14KDa的透析袋用去离子水透析1-2d，每4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕士媛，贾爱群，周金伟，袁胜涛，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32