一种藁本内生菌的分离、培育方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种藁本内生菌的分离、培育方法及其用途，由藁本茎、藁本叶、藁本根及藁本茎叶根混合物中均分离得到了藁本内生菌，实验结果显示藁本内生菌，尤其是藁本根内生菌可明显提高藁本扦插的生根率，缩短藁本扦插的生根时间，可显著提高藁本种子的发芽率，缩短藁本种子萌发所需时间，从而有利于将藁本种子繁殖广泛应用于藁本的人工栽培中，促进藁本产业的更快发展。

Isolation, cultivation and application of endophytic bacteria from Ligusticum

The present invention relates to a method for isolation and cultivation of endophytic bacteria in Ligusticum and its application. The endophytic bacteria in Ligusticum were isolated from the mixture of Ligusticum stem, Ligusticum leaf, Ligusticum root and Ligusticum stem-leaf root. The experimental results show that the endophytic bacteria in Ligusticum, especially the endophytic bacteria in Ligusticum root, can significantly improve the rooting rate of Ligusticum cuttings, shorten the rooting time of Ligusticum cuttings, and significantly improve the rooting time of Ligusticum seeds. The germination rate can shorten the time needed for the germination of Ligusticum chinense seeds, which is conducive to the application of Ligusticum chinense seed propagation in artificial cultivation, and promote the faster development of Ligusticum chinense industry.

【技术实现步骤摘要】
一种藁本内生菌的分离、培育方法及其用途
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种藁本内生真菌的分离、培育方法及其用途。
技术介绍
藁本，为伞形科植物藁本或辽藁本的干燥根茎和根，味辛，性温，归膀胱经，具有祛风散寒、除湿止痛的功效，常用于风寒感冒、奠顶疼痛、风湿痹痛等症的治疗。现代药理研究显示藁本具有中枢抑制、抗炎、抗腹泻、抗血栓、抗缺氧等活性，藁本的丙酮提取物还具有杀虫活性。随着藁本活性的发现和应用，采挖野生藁本已经远远不能满足日益增大的藁本的需求量，人工栽培藁本的规模不断扩大。由于藁本种子具有休眠特性，目前藁本的栽培主要以茎杆培育、插穗等无性繁殖为主，严重制约了藁本产业规模的扩大速度。植物内生菌是指在一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。19世纪人们已经开始对植物内生菌进行研究，早在1898年人们就从黑麦草中分离得到了首株内生真菌。植物内生菌具有多种活性，可产生植物生长所需的调节类物质，增强植物的营养吸收，促进植物的生长发育，提高宿主植物的抗逆性，还可为宿主植物提供营养来源，保障宿主植物的正常生长发育。针对植物内生菌的研究日益受到重视，中国、印度、巴西、美国、日本、韩国等国均已经针对植物内生菌开展了广泛的研究，我国已经针对铁皮石斛、天麻、金线莲、降香、滇重楼、盾叶薯蓣、沉香、银杏、无花果等的内生菌在宿主植物生长发育、种子萌发、有效成分累积方面开展了深入的研究，但并未有针对藁本内生菌的研究报道。因此，本专利技术致力于开发一种藁本内生菌的分离、培养方法和其用途。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种藁本内生菌的分离、培育方法及其用途。一方面，本专利技术提供一种藁本内生菌的分离、培育方法，其包括以下步骤：(1)备料：选取无霉变的鲜藁本全株植物，清洗表面泥沙后备用；(2)表面杀菌：将藁本全株植物采用辐照灭菌后，使用75％乙醇浸泡3-10分钟后，使用无菌水冲洗3-5次；(3)粉碎后培养：使用灭菌工具分别将藁本茎、叶、根剪碎，并将茎、叶、根、茎叶根的1∶1∶1混合物后种植于培养皿中，于27℃恒温培养箱培养3-7天；(4)纯化：挑取菌落边缘菌丝于水琼脂培养基中，培养3-7天，得藁本内生菌。优选的所述步骤(2)使用75％乙醇浸泡5分钟后，使用无菌水冲洗4次；所述步骤(3)中于27℃恒温培养箱培养5天；所述步骤(4)中培养5天。再一个方面，本专利技术提供藁本内生菌在藁本育苗中的应用；优选的，所述藁本内生菌为藁本茎、叶、根内生菌或茎叶根混合物内生菌，更优选的，所述藁本内生菌为藁本根内生菌；优选的所述藁本育苗选自：扦插、种子发芽，更优选的，所述藁本育苗为种子发芽。具体的，本专利技术提供藁本内生菌促进藁本扦插生根的方法，其包括以下步骤：(1)准备扦插枝：剪取藁本茎枝，选取茎节中部，节膨大，带有1-2片成熟叶子的部分备用；(2)藁本内生菌的培养：将分离得到的藁本内生菌接种于含有液体培养基的锥形瓶，摇床培养5-10天后，将藁本扦插枝插入锥形瓶中，继续培养1-3天后，取出藁本扦插枝，使用无菌水清洗3-5次，得藁本内生菌处理的藁本扦插枝，备用；(3)扦插：取经步骤(2)得到的藁本内生菌处理的藁本扦插枝，扦插于土壤中，扦插后踏实土壤，使用50％多菌灵的1000倍液浇透，即可。优选的，所述藁本内生菌选自藁本茎、叶、根内生菌或茎叶根混合物内生菌，更优选的，所述藁本内生菌为藁本根内生菌；优选的，步骤(1)中剪取藁本茎枝，选取茎节中部，节膨大，带有1片成熟叶子的部分备用；优选的，步骤(2)中将分离得到的藁本内生菌接种于含有液体培养基的锥形瓶，摇床培养8天后，将藁本扦插枝插入锥形瓶中，继续培养2天后，取出藁本扦插枝，使用无菌水清洗4次，得藁本内生菌处理的藁本扦插枝，备用。具体的，本专利技术还提供藁本内生菌促进藁本种子发芽的方法，其包括以下步骤：(1)藁本种子的采集与前处理：秋季采收的藁本种子，采收后阴干，育种前使用清水清洗藁本种子，将清洗后的藁本种子于75％乙醇溶液中浸泡3-10分钟后，使用无菌水清洗3-5次后得灭菌藁本种子备用；(2)藁本内生菌的培养：将分离得到的藁本内生菌接种于含有液体培养基的锥形瓶，摇床培养5-10天后，在锥形瓶中加入灭菌后的藁本种子，继续培养2-4天后，取出藁本种子使用75％乙醇浸泡3-10分钟后使用无菌水清洗1-2次，得藁本内生菌处理的藁本种子，备用；(3)砂藏：取经步骤(2)得到的藁本内生菌处理的藁本种子，放置于经高压灭菌的湿润细砂中，种子与细砂的体积比为1∶1-5，于20-25℃条件下砂藏3-8天，待部分种子露白，即可进行种子萌发；(4)：种子萌发：将经步骤(3)砂藏的藁本种子置于室温培养箱下培养5-20天，保持湿度为50-70％。优选的，所述藁本内生菌选自藁本茎、叶、根内生菌或茎叶根混合物内生菌，更优选的，所述藁本内生菌为藁本根内生菌；优选的，步骤(1)中将清洗后的藁本种子于75％乙醇溶液中浸泡5分钟后，使用无菌水清洗4次后得灭菌藁本种子备用；优选的，步骤(2)中将分离得到的藁本内生菌接种于含有液体培养基的锥形瓶，摇床培养8天后，在锥形瓶中加入灭菌后的藁本种子，继续培养3天后，取出藁本种子使用75％乙醇浸泡5分钟后使用无菌水清洗1次，得藁本内生菌处理的藁本种子，备用；优选的，步骤(3)中种子与细砂的体积比为1∶3，于24℃条件下砂藏6天；优选的，步骤(4)中将经步骤(3)砂藏的藁本种子置于室温培养箱下培养12天，保持湿度为60％。本专利技术有益效果本专利技术分离得到了藁本茎、叶、根内生菌和茎叶根混合物内生菌内生菌，并筛选测试了藁本内生菌对于藁本扦插、种子发芽等育苗方式的影响，藁本内生菌，尤其是藁本根内生菌可明显提高藁本扦插的生根率，缩短藁本扦插的生根时间，可显著提高藁本种子的发芽率，缩短藁本种子萌发所需时间，从而有利于将藁本种子繁殖广泛应用于藁本的人工栽培中，促进藁本产业的更快发展。具体实施方式在下文中更详细地描述了本专利技术以有助于对本专利技术的理解。实施例1：一种藁本内生菌的分离、培育方法其包括以下步骤：(1)备料：选取无霉变的鲜藁本全株植物，清洗表面泥沙后备用；(2)表面杀菌：将藁本全株植物采用辐照灭菌后，使用75％乙醇浸泡5分钟后，使用无菌水冲洗4次；(3)粉碎后培养：使用灭菌工具分别将藁本茎、叶、根剪碎，并将茎、叶、根、茎叶根的1∶1∶1混合物后种植于培养皿中，于27℃恒温培养箱培养5天；(4)纯化：挑取菌落边缘菌丝于水琼脂培养基中，培养5天，得藁本内生菌。实施例2：藁本内生菌对藁本扦插生根时间的影响2.1实验材料：剪取藁本茎枝，选取茎节中部，节膨大，带有1片成熟叶子的部分共240只，随机分为空白组、藁本茎内生菌组、藁本叶内生菌组、藁本根内生菌组、藁本茎叶根混合物内生菌组和200mg/L萘乙酸组，每组40只；2.2实验方法：将分离得到的藁本内生菌接种于含有液体培养基的锥形瓶，摇床培养8天后，将藁本扦插枝插入锥形瓶中，其中空白组使用无菌水，继续培养2天后，取出藁本扦插枝，使用无菌水清洗3-5次，得空白处理和藁本内生菌处理的藁本扦插枝，200mg/L萘乙酸组使用200mg/L的萘乙酸溶液蘸扦插枝10秒，将各组藁本扦插枝扦插于土壤中，扦插后踏实土壤，使用50％多菌灵的1000倍液浇透，观察扦插7天后藁本扦插枝的生根率，具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种藁本内生菌的分离、培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)备料：选取无霉变的鲜藁本全株植物，清洗表面泥沙后备用；(2)表面杀菌：将藁本全株植物采用辐照灭菌后，使用75％乙醇浸泡3‑10分钟后，使用无菌水冲洗3‑5次；(3)粉碎后培养：使用灭菌工具分别将藁本茎、叶、根剪碎，并将茎、叶、根、茎叶根的1∶1∶1混合物后种植于培养皿中，于27℃恒温培养箱培养3‑7天；(4)纯化：挑取菌落边缘菌丝于水琼脂培养基中，培养3‑7天，得藁本内生菌。

【技术特征摘要】
1.一种藁本内生菌的分离、培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)备料：选取无霉变的鲜藁本全株植物，清洗表面泥沙后备用；(2)表面杀菌：将藁本全株植物采用辐照灭菌后，使用75％乙醇浸泡3-10分钟后，使用无菌水冲洗3-5次；(3)粉碎后培养：使用灭菌工具分别将藁本茎、叶、根剪碎，并将茎、叶、根、茎叶根的1∶1∶1混合物后种植于培养皿中，于27℃恒温培养箱培养3-7天；(4)纯化：挑取菌落边缘菌丝于水琼脂培养基中，培养3-7天，得藁本内生菌。2.根据权利要求1所述的藁本内生菌的分离、培育方法，其特征在于，所述步骤(2)使用75％乙醇浸泡5分钟后，使用无菌水冲洗4次；所述步骤(3)中于27℃恒温培养箱培养5天；所述步骤(4)中培养5天。3.权利要求1-2任一项所分离得到的藁本内生菌在藁本育苗中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述藁本内生菌选自藁本茎内生菌、藁本叶内生菌、藁本根内生菌或藁本茎叶根混合物内生菌。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述藁本内生菌为藁本根内生菌。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述藁本育苗选自：扦插或种子发芽。7.权利要求1-2任一项所分离得到的藁本内生菌促进藁本扦插生根的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)准备扦插枝：剪取藁本茎枝，选取茎节中部，节膨大，带有1-2片成熟叶子的部分备用；(2)藁本内生菌的培养：将分离得到的藁本内生菌接种于含有液体培养基的锥形瓶，摇床培养5-10天后，将藁本扦插枝插入锥形瓶中，继续培养1-3天后，取出藁本扦插枝，使用无菌水清洗3-5次，得藁本内生菌处理的藁本扦插枝，备用；(3)扦插：取经步骤(2)得到的藁本内生菌处理的藁本扦插枝，扦插于土壤中，扦插后踏实土壤，使用50％多菌灵的1000倍液浇透，即可。8.根据权利要求7所述的藁本内生菌促进藁本扦插生根的方法，其特征在于，步骤(1)中剪取藁本茎枝...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧平，欧洋，
申请(专利权)人：四川诚隆药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51