一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP及其应用制造技术

一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术一方面提供了一种新的菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP，另一方面提供了菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP在孕茭中的用途。本发明专利技术的有益效果：本发明专利技术的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UeTSP能够直接侵染茭白植株，使茭白孕茭，而不产生冬孢子，即不形成灰角这种不利的表型，为茭白人工孕茭提供了一种新思路。

A Haploid Strain UeTSP of Powdery Zizania and Its Application

A haploid strain UeTSP of powdery mildew and its application belong to the field of biotechnology. On the one hand, the invention provides a new haploid strain UeTSP of powdery mildew, on the other hand, it provides the use of the haploid strain UeTSP of powdery mildew in pregnant stubble. The beneficial effect of the invention is that the haploid strain UeTSP of Ustilago esculenta of the invention can directly infect the Zizania latifolia plant, so that the pregnant Zizania latifolia can not produce winter spores, that is, the unfavorable phenotype of gray horn is not formed, thus providing a new idea for the pregnant Zizania latifolia.

【技术实现步骤摘要】
一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP及其应用。
技术介绍
菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）是一种独特的病原真菌，其侵染茭白植株（Zizanialatifolia）后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成可食用的茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国，茭白是一种营养很高的水生蔬菜，也是一种重要的药材。但是田间常出现充满冬孢子的灰茭和少量冬孢子形成的芝麻茭，误食后易形成肺炎，不利于茭白产业的发展。鉴于人工育种技术的成功开发，如何控制茭白中菰黑粉菌冬孢子的形成将是茭白人工育种的一大关键。前期研究发现，菰黑粉菌与其他二型态真菌类似，存在酵母型和菌丝型两种型态，而由酵母型向菌丝型转换是此类真菌致病性的关键。在菰黑粉菌中，其二型态转换受到a，b基因的调控，需要两个性亲和单倍体融合形成双核菌丝，在侵染过程中受环境因子影响菌丝内两个细胞核核融形成一个二倍体的核从而产生二倍体的冬孢子。申请人在长期研究过程中发现自龙茭2号灰茭中分离得到单倍体菌株UET1（交配基因型为a1b1，该菌株在CN105838616A的专利技术专利中已经公开，保藏号为CGMCCNo.11843）和UET2（交配基因型为：a2b2，该菌株在CN105838615A的专利技术专利中已经公开，保藏号为：CGMCCNo.11844）。当UET1与UET2两个性亲和菰黑粉菌共培养时，体外培养的菌落从酵母型向菌丝型转变，菌落生长气生菌丝，菌丝可以侵染茭白，使茭白孕茭，但是容易产生灰茭。由于上述情况的出现，对人工孕茭带来不必要的麻烦。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP及其应用的技术方案。本专利技术提供了一种菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）单倍体菌株UeTSP，该菌株于2018年06月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.15929。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术还提供了一种菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）单倍体菌株UeTSP的应用，该菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）单倍体菌株UeTSP能够侵染茭白植株使茭白正常孕茭。本专利技术还提供了一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP的获得方法，其特征在于包括以下步骤：1）获得UET1菌株基因组DNA；2）以UET1菌株基因组DNA为模板，以mfa1.2F和mfa1.2R，bE1F和bE1R为引物进行PCR,获得mfa1.2和bE1基因序列，所述的mfa1.2F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，bE1F的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，bE1R的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；3）用mfa1.2F和bE1R引物，以mfa1.2和bE1基因序列为模板，进行融合PCR，将mfa1.2和bE1基因连接成一个长片段；4）将融合PCR产物和pUMa932质粒经限制性内切酶ECORⅤ和HindⅢ双酶切2h后的产物，连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后提取重组质粒，测序确认后获得重组质粒mfa1.2-bE1-amp-cbx；5）使用限制性内切酶PvuⅠ线性化重组质粒mfa1.2-bE1-amp-cbx，利用PEG介导的转化将线性化的片段转入UET2原生质体中，涂布于含50μg/mL萎锈灵的双层再生培养基上，28℃培养4-5天，随后挑取转化子至含有萎锈灵的YEPS固体培养基上，然后挑取单菌落扩大培养，观察菌落是否有菌丝生长，获得UeTSP菌株。本专利技术的有益效果：本专利技术的菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）单倍体菌株UeTSP能够直接侵染茭白植株，使茭白孕茭，而不产生冬孢子，即不形成灰角这种不利的表型，为茭白人工孕茭提供了一种新思路。附图说明图1为pUMa932质粒图谱；图2为pUMa932质粒经双酶切图；图3为mfa1.2和bE1基因电泳扩增图；图4为mfa1.2和bE1基因融合PCR结果图；图5为转化子菌液PCR结果；图6为质粒载体经PvuⅠ酶切图；图7为构建的UeTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（下）及菌落（上）形态显微观察图；图8为茭白经UeTSP菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实例1：菰黑粉菌UET1菌株中基因组DNA的提取1、提前半小时在65℃水浴锅内水浴加热CTAB提取液。2、用枪头取UET14菌体（厚度约5mm）于2.0mL离心管中，加入10颗左右不锈钢钢珠（直径1mm），标记。通风橱内，加入800ul预热的CTAB提取液。震荡仪70Hz，震荡150s，破碎菌体。3、65℃水浴1h。4、加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀。5、通风橱内，室温静置15min。室温，10000rpm离心10min。此时离心管内出现分层现象，上清中含有核酸，中间是蛋白层，底部为钢珠和杂质。小心吸取上清液至新的1.5mL离心管中（可一直重复4、5步，直至肉眼不可见中间蛋白层）。8、向上清中加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，可直接离心或静置5-10min后离心。9、预冷离心机至4℃，然后4℃，10000rpm离心10min。10、倒上清，加1mL的75%乙醇，轻轻颠倒洗涤DNA。4℃，10000rpm离心5min，弃上清。11、弃去上清后，可置于37℃烘箱中或倒扣在纸巾上5-10min进行干燥，亦可采用其他干燥方式。若底部有残留乙醇也无碍。12、加入30ul无菌水溶解DNA，50℃水浴20min，去除挥发物。-20℃保存。实例2：mfa1.2基因的克隆以实例1中获得的UET1菌株中基因组DNA为模板，根据设计的mfa1.2F和mfa1.2R引物，克隆mfa1.2基因。mfa1.2F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。PCR扩增体系：（50ul）10×PCRbuffer（takara）5uldNTPmix（takara）4ulmfa1.2F1ulmfa1.2R1ulLATaq（takara）0.5ulddH2O37.5ulUET1DNA1ulPCR反应条件如下：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。实例3：bE1基因的克隆以实例1中获得的UET1UET1菌株中基因组DNA为模板，根据设计的bE1F和bE1R引物进行PCR，克隆bE1基因。bE1F的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，bE1R的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。PCR扩增体系：（50ul）10×PCRbuffer（takara）5uldNTPmix（takara）4ulbE1F1ulbE1R1ulLATaq（takara）0.5ulddH2O37.5ulUET1UET1DNA1ulPCR反应条件如下：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。mfa1.2和bE1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菰黑粉菌（Ustilago esculenta）单倍体菌株UeTSP，保藏号为：CGMCC No.15929。

【技术特征摘要】
1.一种菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）单倍体菌株UeTSP，保藏号为：CGMCCNo.15929。2.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP在侵染茭白植株使茭白正常孕茭中的应用。3.如权利要求1所述的一种菰黑粉菌单倍体菌株UeTSP的获得方法，其特征在于包括以下步骤：1）获得UET1菌株基因组DNA；2）以UET1菌株基因组DNA为模板，以mfa1.2F和mfa1.2R，bE1F和bE1R为引物进行PCR,获得mfa1.2和bE1基因序列，所述的mfa1.2F的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，bE1F的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，bE1R的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；3）用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雅芬，叶子弘，于金梦，夏文强，俞晓平，崔海峰，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33