The present invention provides a method for culturing high-yield vinblastine of Changchun flower cells, which includes the following steps: 1) cultivating callus of Changchun flower; 2) cultivating stable hereditary Changchun flower cell line; 3) inoculating the obtained Changchun flower cell line into liquid suspension medium for induction culture to stimulate the accumulation of alkaloids in Changchun flower. The induction conditions are as follows: Changchun flower cell line; Starting from the 10th to 15th day of liquid suspension culture, the culture temperature was lowered from 32 35 to 25 28 C, carbon monoxide gas was introduced, and nicotinic acid, ecdysone and Silver Thiosulfate were added to liquid suspension culture medium. After 2 3 days of continuous culture, the culture temperature was restored to 32 35 and the culture time was 4 5 days. The temperature was raised and lowered alternately until the culture time was reached. At the end of the culture, high vinblastine-producing Changchunhua cells were obtained. The invention has the characteristics of fast growth speed and high vinblastine accumulation content.
【技术实现步骤摘要】
长春花细胞高产长春碱的培养方法
本专利技术属于细胞培养
更具体地说，本专利技术涉及一种长春花细胞高产长春碱的培养方法。
技术介绍
长春花，别名金盏草、四时春、日日新、雁头红、三万花，为夹竹桃科长春花属一种植物。目前，已经从长春花中分离出了100多种萜类吲哚生物碱，如长春碱、长春新碱、蛇根碱、文多灵碱等，从长春花中分离出来的许多生物碱均具有抗肿瘤活性，其中，长春碱是目前长春花中药用价值最大的、应用最广泛的生物碱。然而，长春花植株体内的长春碱含量及其微少，使得从长春花植株中提取的长春碱远远不能满足市场需求。
技术实现思路
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本专利技术的专利技术人已经发现，在液体悬浮培养基中含有尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的情况下通入一氧化碳后能提高长春花细胞中长春碱的含量。基于这种发现，完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其能够促进长春花细胞的生长、提高单位时间单位体积培养液中的细胞含量，进而提高长春碱的含量。为了实现根据...
【技术保护点】
1.一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10‑20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10‑20mg/L维生素C、7‑9g/L琼脂和0.1‑0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32‑35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20‑25天继代一次，继代培养3‑5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基...
【技术特征摘要】
1.一种长春花细胞高产长春碱的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10-20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10-20mg/L维生素C、7-9g/L琼脂和0.1-0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32-35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20-25天继代一次，继代培养3-5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8-10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100-120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20-22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10-15天开始，将培养温度从32-35℃降低至25～28℃，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，维持该温度继续培养2-3天后，恢复培养温度到32-35℃，培养4-5天，交替的进行升温和降温培养，直至该培养结束，获得高产长春碱的长春花细胞。2.根据权利要求1所述的长春花细胞高产长春碱的培养方法...
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