提高长春花细胞中长春碱含量的方法技术

本发明专利技术提供一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法，其包括以下步骤：1)培育长春花愈伤组织；2)培育稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10‑15天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，交替的使用蓝色LED灯和红色LED灯进行光照培养，蓝色LED灯的光强为500‑800lx，光照时间为7‑11h/day，红色LED灯的光强为1000‑1500lx，光照时间为11‑17h/day，直至该培养结束，获得高长春碱含量的长春花细胞。本发明专利技术具有培养周期短、长春碱累积含量高等特点。

Method of Increasing Vincristine Content in Vincris roseus Cells

The invention provides a method for improving the content of vinblastine in Changchun flower cells, which comprises the following steps: 1) cultivating callus of Changchun flower; 2) cultivating stable hereditary Changchun flower cell lines; 3) inoculating the obtained Changchun flower cell lines into liquid suspension medium for induction culture to stimulate the accumulation of alkaloids in Changchun flower. The induction conditions are as follows: Changchun flower cells; Starting from the 10th to 15th day of liquid suspension culture, carbon monoxide gas and Silver Thiosulfate were added into liquid suspension culture medium. The light intensity of blue LED lamp and red LED lamp was 500 800lx, 7 11h/day, 1000 1500lx and 1 1 17h / day, until the end of the culture, the cells with high vinblastine content were obtained. The invention has the characteristics of short culture period and high vinblastine accumulation content.

【技术实现步骤摘要】
提高长春花细胞中长春碱含量的方法
本专利技术属于细胞培养
更具体地说，本专利技术涉及一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法。
技术介绍
长春花，别名金盏草、四时春、日日新、雁头红、三万花，为夹竹桃科长春花属一种植物。目前，已经从长春花中分离出了100多种萜类吲哚生物碱，如长春碱、长春新碱、蛇根碱、文多灵碱等，从长春花中分离出来的许多生物碱均具有抗肿瘤活性，其中，长春碱是目前长春花中药用价值最大的、应用最广泛的生物碱。虽然利用植物细胞培养能有效提高长春碱的产量，但是植物细胞的培养周期较长，培养成本较高。
技术实现思路
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本专利技术的专利技术人已经发现，在诱导产生长春碱的过程中，使用蓝色LED灯和红色LED灯交替的照射培养的植物细胞，能有效的缩短长春花细胞的诱导周期，迅速提高长春花细胞中的长春碱含量。基于这种发现，完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法，其能够促进长春花细胞的生长、提高单位时间单位体积培养液中的细胞含量，进而提高长春碱的含量。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10-20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10-20mg/L维生素C、7-9g/L琼脂和0.1-0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32-35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20-25天继代一次，继代培养3-5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8-10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100-120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20-22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10-15天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，交替的使用蓝色LED灯和红色LED灯进行光照培养，蓝色LED灯的光强为500-800lx，光照时间为7-11h/day，红色LED灯的光强为1000-1500lx，光照时间为13-17h/day，直至该培养结束，获得高长春碱含量的长春花细胞。优选的是，所述愈伤组织诱导培养基为含有1～2mg/L细胞分裂素、0.1～0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、20～30g/L蔗糖、3-5mg/L甘草黄酮和5～8g/L琼脂的B5基础培养基。优选的是，所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为0.5～1.0mmol/L。优选的是，所述液体悬浮培养基为含有添加有甘草黄酮、白藜芦醇、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖的B5基础培养基，所述甘草黄酮的浓度为0.005-0.008mg/L，白藜芦醇的浓度为0.001-0.003mg/L，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.08-0.1mg/L，萘乙酸的浓度为0.2-0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.06-0.09mg/L、蔗糖的浓度为20-30g/L的B5基础培养基。优选的是，所述液体培养基中还包括色氨酸和水解酪蛋白，所述色氨酸的浓度为20-30mg/L，所述水解酪蛋白的含量为50-70mg/L。优选的是，所述一氧化碳的通入量为0.01-0.03m3/h。优选的是，所述尼克酸的浓度为0.05-0.1mg/L，所述蜕皮激素的浓度为0.06-0.08mg/L，所述硫代硫酸银的浓度为0.02-.0.05mg/L。本专利技术至少包括以下有益效果：通过使用弱酸电解水浸泡消毒长春花种子，能提高长春花种子的发芽率8％以上；使用本专利技术的愈伤组织诱导培养基，能有效的避免细胞出现褐化，并且能缩短诱导周期；在含有尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的液体培养基中通入一氧化碳，促使长春花细胞中合成长春碱关键基因d4h和dat基因表达量增加了1倍，提高了长春碱的生物合成量；通过交替的使用蓝色LED灯和红色LED灯，能缩短诱导周期7天以上；。本专利技术具有细胞生长速度快、长春碱累积含量高等特点。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/L维生素C、7g/L琼脂和0.1g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，交替的使用蓝色LED灯和红色LED灯进行光照培养，蓝色LED灯的光强为500lx，光照时间为10h/day，红色LED灯的光强为1500lx，光照时间为14h/day，直至该培养结束，获得高长春碱含量的长春花细胞。与使用酒精或高锰酸钾消毒液相比，使用弱酸电解水浸泡消毒后，长春花的种子发芽率提高了8.9％。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量PCR技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了95％和96％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，本实施例长春花细胞经冻干后，分别检测文多灵和长春碱的含量，发现文多灵含量提升了90％，长春碱含量提高了96％，说明通入一氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10‑20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10‑20mg/L维生素C、7‑9g/L琼脂和0.1‑0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32‑35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20‑25天继代一次，继代培养3‑5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8‑10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100‑120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20‑22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10‑15天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，交替的使用蓝色LED灯和红色LED灯进行光照培养，蓝色LED灯的光强为500‑800lx，光照时间为7‑11h/day，红色LED灯的光强为1000‑1500lx，光照时间为11‑17h/day，直至该培养结束，获得高长春碱含量的长春花细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种提高长春花细胞中长春碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10-20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10-20mg/L维生素C、7-9g/L琼脂和0.1-0.3g/L寡糖素的B5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32-35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20-25天继代一次，继代培养3-5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8-10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100-120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20-22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第10-15天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，交替的使用蓝色LED灯和红色LED灯进行光照培养，蓝色LED灯的光强为500-800lx，光照时间为7-11h/day，红色LED灯的光强为1000-1500lx，光照时间为11-17h/day，直至该培养结束，获得高长春碱含量的长春花细胞。2.根据权利要求1所述的提高长...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃家日，
申请(专利权)人：覃家日，
类型：发明
国别省市：广西,45