用于基因分型检测α制造技术

本发明专利技术提供一种用于基因分型检测α

Detection of alpha for genotyping

The invention provides a method for genotyping detection of alpha.

【技术实现步骤摘要】
用于基因分型检测α+缺失型地中海贫血的引物组及试剂盒
本专利技术属于分子生物学医药领域，具体涉及一种用于基因分型检测α+缺失型地中海贫血的引物组及试剂盒。
技术介绍
地中海贫血是(简称地贫)是世界上最常见的血液系统遗传病之一，呈现常染色体隐性遗传规律。主要分为α地中海贫血(α-地贫)和β地中海贫血(β-地贫)两类，分别由于α-珠蛋白基因或β-珠蛋白基因缺失、突变等缺陷引起对应的珠蛋白链的合成受到抑制或其功能丧失所致。该病高发于从地中海沿岸的意大利、希腊、马耳他、塞浦路斯到东南亚各国的广大地区。我国南方也是本病的高发地区，在广西、广东，α-地贫基因的人群携带率分别高达17.55％.8.53％。由于α-地贫具有普遍性、人口基数大、涉及范围广等特点，包括我国南方在内的重症地中海贫血患儿的出生是世界公认的公共健康卫生问题。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α和β珠蛋白链之间保持适当比例(1:1)，形成具有功能的血红蛋白四聚体，极少或没有剩余的α-链或β-链。当珠蛋白基因在体内发生缺失、突变等基因缺陷时，致使血红蛋白四聚体中的珠蛋白肽链一种或几种合成缺乏或减少，而引起体内血红蛋白α-链与β-链比例失衡，进而导致血红蛋白不稳定，冗余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上，红细胞膜的通透性和脆性发生改变，导致溶血性贫血，临床上表现出症状轻重不一的慢性进行性溶血性贫血。临床上，将α链合成减少而β链相对过剩则归类为α-地贫。根据分子缺陷可将其分为:几个核苷酸的插入与缺失或单个碱基替换的非缺失型α-地贫和大片段基因的缺失型α-地贫两大类。而就一个单倍体而言，根据α-珠蛋白合成减少的程度，α-地贫可为两类缺陷:α0地中海贫血(α-地中海贫血1)，特点为α-珠蛋白肤链合成完全受阻，缺失两个α基因(__/αα)；α0地贫基因具有明显的地理分布与种族特征，我国最常见的为--SEA，少见--THAI，而--FIL则更罕见；②α+地中海贫血(α地中海贫2)，表现为α-珠蛋白肤链合成部分受阻，通常缺失一个α基因或一个α基因发生点突变或少数几个碱基的缺失或插入引起(-α/，αTα)，我国最常见的α+地贫基因为-α3.7、-α4.2缺失型突变以及HbWS,HbQS与HbCS等点突变。α-地贫是典型的基因缺失型遗传病，研究资料表明95％以上的α-地贫是由于α-珠蛋白基因大片断缺失(缺失型)所致,其缺失数目是α-地中海贫血临床表现及分型的依据。根据临床表现又将其分为静止型(-α/αα,αTα/αα)、标准型(--/αα,-α/-α,αTα/αTα,-α/αTα)、血红蛋白H病(--/αTα、--/-α)与HbBart's水肿胎儿综合征(--/--)四类。其中临床症状最重的为HbBart's水肿胎儿综合征，患儿通常不能存活；其次为血红蛋白H病(HbH)，其临床表现往往轻重不一，通常非缺失型HbH病人的临床表现往往比缺失型HbH病人更为严重。目前该病尚无理想的治疗方法，研究表明在地贫高发区，对夫妇双方均为地贫基因携带者的孕妇在妊娠早期筛查或中期应用相应分析技术通过遗传筛查和产前基因诊断选择性地淘汰重症α-地贫胎儿则是控制该病发生的首要途径和有效预防措施。因此，对于α+地贫的检测急需一种简单、能快速准确基因分型的技术手段。目前对α-地贫筛查方法如血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳试验等特异性不高，较易产生假阴性。对于α-地中海贫血的分子诊断,SouthernBlot杂交技术是金标准,准确性高,但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测；其他TaqMan探针技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、DNA直接测序和DNA微阵列技术等。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。现有的缺失型α地中海贫血检测相关的专利种类有几种，如缺口PCR(Gap-PCR)、寡核苷酸探针杂交、高分辨的溶解曲线分析、TaqMan探针技术、变性高效液相色谱技术，多重连接酶依赖的探针扩增技术(MLPA)、基因芯片等技术，这些技术均需DNA抽提的操作繁琐复杂、耗时、易交叉污染、实验需要DNA自动提取仪精密仪器和试剂耗材成本昂贵，在临床上无法普遍推广应用。而DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素，并且提取与纯化DNA过程极易污染，使得实验易出现假阴性或者假阳性。目前市场上缺失型地贫检测专利和产品，多采用Gap-PCR结合电泳方法或者基因芯片等技术检测中国常见的缺失型地贫-α3.7和-α4.2，必须提取与纯化DNA，才能继续后续实验，标本提取时间约1-2h，PCR扩增时间检测长达3-4h。必须提取与纯化DNA，才能继续后续实验，标本提取时间约1-2h，PCR扩增时间检测长达3-4h。电泳时间约50-60min或者杂交3h，整个流程时间7h。操作繁琐，耗时长，易污染和降解。尚不能满足临床简洁快速的需要。另外，同时所需样本量多，对于边远地带采集的标本运输需冷链设备，需三级包装系统，标本储存空间大；生物安全风险系数高。本领域关于对全血、羊水和DBS直接检测地贫的技术尚属空白，市场上尚无此类产品。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的是针对现有的检测方法的缺陷，采用直接PCR(DirectPCR)技术，提供一种不需要DNA抽提直接扩增，扩增时间约为2.5h；简便、快捷，灵敏度高的直接检测缺失型α+地贫，单管同时检测缺失型α+地贫(-α3.7和-α4.2)的方法及其试剂盒。该试剂盒可操作简便、分型快速、费用低廉，结果判读直观。本专利技术的技术方案如下：用于基因分型检测α+缺失型地中海贫血的引物组，包括如下引物对：上下游引物序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的3.7F/3.7R；上下游引物序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示的DPAIC-F/DPAIC-R；上下游引物序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的4.2F/4.2R。所述检测指以人体体液和/或人体基因组DNA为模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。用于快速检测α+缺失型地中海贫血基因型的试剂盒，包括所述的引物组。所述快速检测指，直接以人体体液为PCR反应的模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。所述试剂盒还包括用于进行PCR和/或电泳的试剂。所述用于进行PCR的试剂包括dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水、MgCl2；所述用于进行电泳的试剂包括琼脂糖、蒸馏水、核酸染料；所述核酸染料选自：EB、GelGreen、SYBRGreenⅠ、GoldView、GelRed和GelGreen。所述PCR的反应体系为：模板1～4μl；各引物：0.1～1μmol/L；MgCl2浓度为1.5～5mM/L；dNTP的浓度为100～500μM/L；DNA聚合酶的浓度为1～4U/反应；所述PCR的反应体系优选包括下述体积份数的各组分：MightyAmpTaq0.1-1份、2×MightyAmpBuffer10份、DPAIC-F/3.7F0.1-1份、DPAIC-R0.1-1份、4.2F0.1-1、4.2R0.1-1份、3.7R0.1-1份、模板+超纯水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于基因分型检测α+缺失型地中海贫血的引物组，包括如下引物对：上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的3.7F/3.7R；上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的DPAIC‑F/DPAIC‑R；上下游引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的4.2F/4.2R。

【技术特征摘要】
1.用于基因分型检测α+缺失型地中海贫血的引物组，包括如下引物对：上下游引物序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的3.7F/3.7R；上下游引物序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示的DPAIC-F/DPAIC-R；上下游引物序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的4.2F/4.2R。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述检测指以人体体液和/或人体基因组DNA为模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。3.用于快速检测α+缺失型地中海贫血基因型的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述快速检测指，直接以人体体液为PCR反应的模板，用所述引物组进行PCR扩增后，将所得扩增产物进行电泳即可获知结果。5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行PCR和/或电泳的试剂。6.根据权利要求2-4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述用于进行PCR的试剂包括dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水、MgCl2；所述用于进行电泳的试剂包括琼脂糖、蒸馏水、核酸染料；所述核酸染料选自：EB、GelGreen、SYBRGreenⅠ、GoldView、GelRed和GelGreen。7.根据权利要求2-5任一所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR的反应体系为：模板1～4μl；各引物：0.1～1μmol/L；MgCl2浓度为1.5～5mM/L；dNTP的浓度为100～500μM/L；DNA聚合酶的浓度为1～4U/反应；所述PCR的反应体系优选包括下述体积份数的各组分：MightyAmpTaq0.1-1份、2×MightyAmpBuffer10份、DPAIC-F/3.7F0.1-1份、DPAIC-R0.1-1份、4.2F0.1-1、4.2R0.1-1份、3.7R0.1-1份、模板+超纯水4-9.4份；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈治中，卿吉琳，
申请(专利权)人：陈治中，
类型：发明
国别省市：广西,45