人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种人HLA‑F单克隆抗体及其制备方法，将合成基因HLA‑F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒转入表达菌株，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株利用IPTG进行诱导表达，得到目标蛋白HLA‑F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA‑F蛋白对小鼠进行快速免疫，再利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆，得到强阳性细胞株进行腹水制备，纯化处理腹水后，得到所述人HLA‑F单克隆抗体，不仅适用于蛋白免疫印记、ELISA，而且适用于免疫共沉淀、免疫荧光及中和抗体。可阻断肿瘤细胞对NK细胞免疫功能的抑制作用，激活NK细胞靶向杀伤肿瘤细胞。

Human HLA-F monoclonal antibody and its preparation and Application

The present invention relates to a human HLA_F monoclonal antibody and its preparation method. The synthetic gene HLA_F is linked to the vector pCzn1(+), the recombinant plasmid is obtained and transferred into the expression strain. The monoclonal strain with ampicillin resistance is induced to express by IPTG, and the target protein HLA_F inclusion body is renatured in turn, and purified by Ni column. After purification, the purified HLA_F protein has little effect on the expression of ampicillin-resistant monoclonal strain. After rapid immunization in mice, lymphocytes of immunized mice were fused with myeloma cells. Positive pore cells were screened and subcloned. Strong positive cell lines were obtained for ascites preparation. After purification and treatment of ascites, the human HLA_F monoclonal antibody was obtained. It is not only suitable for protein imprinting, ELISA, but also for immunoprecipitation and immunofluorescence. Neutralizing antibodies. It can block the inhibitory effect of tumor cells on the immune function of NK cells and activate NK cells to target and kill tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
人类白细胞抗原(humanleukocyteantigenHLA)表达改变是肿瘤细胞逃避机体免疫的机制之一，HLA可以辅助肿瘤细胞逃避细胞毒性T细胞的识别和杀伤，在各种恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用。虽然HLA-I类分子表达下调可以帮助肿瘤细胞逃避细胞毒性T细胞的识别和杀伤，但同样增强了NK细胞的杀伤活性，然而研究发现HLA-I缺陷的肿瘤细胞仍具有较强生长优势，进一步分析证实由于这些细胞过表达非经典HLA-I类分子(HLA-E，F，G)，进而导致肿瘤细胞免疫逃逸。HLA-F作为新近发现的第三种非经典HLA-I类分子，其功能及临床意义研究刚刚起步。与HLA-E相似，HLA-F可结合抑制性受体CD94/NKG2A，抑制NK细胞及部分CD8+T细胞的杀伤活性，逃避机体免疫杀伤。但是，目前市面上HLA-F抗体多以检测蛋白免疫印迹为主，尚不能作为中和抗体使用。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了人HLA-F单克隆抗体及其制备方法和应用。本专利技术所述HLA-F单克隆抗体能与HLA-F特异性结合，不与人类HLA-I类其他分子结合；不仅适用于蛋白免疫印记(WB)、ELISA，而且适用于免疫共沉淀(IP)、免疫荧光(IF)及中和抗体。当结合到人肿瘤细胞上的HLA-F时，可阻断肿瘤细胞对NK细胞免疫功能的抑制作用，从而激活NK细胞靶向杀伤肿瘤细胞。本专利技术还涉及包括所述人HLA-F单克隆抗体或其片段的药物组合物在制备用于治疗肿瘤患者的药物中应用。本专利技术所采用的技术方案为：一种人HLA-F单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)将合成基因HLA-F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒pCzn1(+)-HLA-F；(2)将质粒pCzn1(+)-HLA-F转入表达菌株，得到载体融合蛋白；之后采用IPTG诱导所述载体融合蛋白进行表达，得到目标蛋白HLA-F包涵体；(3)对步骤(2)所述目标蛋白HLA-F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA-F蛋白；(4)利用步骤(3)所述纯化后HLA-F蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆；(5)筛选经步骤(4)亚克隆后得到的强阳性细胞株进行腹水制备，对腹水进行纯化处理后，即得所述人HLA-F单克隆抗体。步骤(2)中，所述表达菌株为大肠杆菌TM。将所述质粒pCzn1(+)-HLA-F转入所述表达菌株的具体操作如下：将质粒分散于双蒸水中(浓度为100ng/μl)，将感受态表达菌株悬浮于含甘油15％、浓度为0.1mol/L的CaCl2溶液中(细胞数为5×106个)，之后取1μl分散有质粒的双蒸水加入到100μl悬浮有感受态表达菌株的CaCl2溶液中，置于冰上20min；之后在42℃热敷90s，再迅速置冰中5min，加入600μlLB培养液；33℃、220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，33℃倒置培养过夜，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株。采用IPTG诱导表达的具体操作如下：取LB平板上具有氨苄西林抗性的单克隆菌株接种于含50μg/ml氨苄青霉素的3mlLB培养液的试管中，33℃、220r/min振摇过夜；次日按体积比1:100接种于含50μg/ml氨苄青霉素的30mlLB培养液中，33℃、220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，33℃、220r/min振摇4h，诱导表达目标蛋白HLA-F，10000r/min室温离心2min，弃上清，即得目标蛋白HLA-F包涵体。对所述目标蛋白HLA-F包涵体进行变复性处理的具体操作如下：将所述目标蛋白HLA-F包涵体重悬于20ml裂解液，超声破碎后，4℃10000r/min室温离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液洗涤沉淀3次；用溶解缓冲液溶解沉淀，所述溶解缓冲液与所述沉淀的体积为10:1，4℃放置过夜，室温，10000r/min离心15min，得到上清液在搅拌条件下缓慢滴加至含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的缓冲液中，得到蛋白溶液装入透析袋于含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的溶液中透析过夜，得到变复性处理后的HLA-F包涵体。对所述变复性处理后的HLA-F包涵体进行Ni柱纯化处理的具体操作如下：利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至镍离子亲和层析柱，先用镍离子亲和层析柱(Ni2+-IDA)结合缓冲液以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；接着用镍离子亲和层析柱(Ni2+-IDA)洗涤液(20mMTris-HCl、20mM咪唑、0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值达到基线；之后用镍离子亲和层析柱(Ni2+-IDA)洗脱液(20mMTris-HCl、250mM咪唑、0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集蛋白流出液；最后将蛋白流出液加入透析袋于含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的溶液中透析过夜，得到纯化后HLA-F蛋白。淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合实验的具体操作如下：按照数量比1:5混合骨髓瘤细胞和淋巴细胞，得到细胞混合物；将所述细胞混合物放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后在1000rpm条件下离心5min，弃上清，摇动离心管使细胞均匀，缓慢加入0.8ml50％PEG，反应90秒，然后加入20-30mlDMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到33℃水浴锅中反应10min，在1000rpm条件下离心5min，弃上清后加入HATDMEM培养基；把融合的细胞辅到96孔板中，每孔100μl；然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养，融合10天后，融合筛选阳性孔细胞。所述亚克隆的具体操作如下：吹打阳性孔中细胞，计数为N，在离心管中加入N/4mlDMEM培养基，取100μl细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100μl在管底；在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴，管底留1.8-2ml，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml，补加DMEM至2.8-3ml，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，3-10天后，筛选呈阳性的单克隆孔扩大培养定株。对腹水进行纯化处理的操作具体如下：将蛋白质A琼脂糖凝胶介质装入镍离子亲和层析柱，将腹水与PBS按照体积比1:1等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得所述人HLA-F单克隆抗体。所述方法制备得到的人HLA-F单克隆抗体。所述单克隆抗体在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的人HLA-F单克隆抗体的制备方法，将合成基因HLA-F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒pCzn1(+)-HLA-F转入大肠杆菌TM表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人HLA‑F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将基因HLA‑F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒pCzn1(+)‑HLA‑F；(2)将质粒pCzn1(+)‑HLA‑F转入表达菌株，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株；之后采用IPTG进行诱导表达，得到目标蛋白HLA‑F包涵体；(3)对步骤(2)所述目标蛋白HLA‑F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA‑F蛋白；(4)利用步骤(3)所述纯化后HLA‑F蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆；(5)筛选经步骤(4)亚克隆后得到的强阳性细胞株进行腹水制备，对腹水进行纯化处理后，即得所述人HLA‑F单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将基因HLA-F连入载体pCzn1(+)，获得重组质粒pCzn1(+)-HLA-F；(2)将质粒pCzn1(+)-HLA-F转入表达菌株，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株；之后采用IPTG进行诱导表达，得到目标蛋白HLA-F包涵体；(3)对步骤(2)所述目标蛋白HLA-F包涵体依次进行变复性处理、Ni柱纯化处理，得到纯化后HLA-F蛋白；(4)利用步骤(3)所述纯化后HLA-F蛋白对小鼠进行快速免疫，得到免疫小鼠，利用免疫小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，之后筛选出阳性孔细胞并进行亚克隆；(5)筛选经步骤(4)亚克隆后得到的强阳性细胞株进行腹水制备，对腹水进行纯化处理后，即得所述人HLA-F单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表达菌株为大肠杆菌TM；将所述质粒pCzn1(+)-HLA-F转入所述表达菌株的具体操作如下：量取1μl含质粒浓度100ng/μl的质粒水溶液，加入到100μl含细胞数为5×106个的感受态表达菌株CaCl2悬浮液中，置于冰上20min；之后在42℃热敷90s，再迅速置冰中5min，加入600μlLB培养液；33℃、220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，33℃倒置培养过夜，得到具有氨苄西林抗性的单克隆菌株；采用IPTG诱导表达的具体操作如下：取LB平板上具有氨苄西林抗性的单克隆菌株接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，33℃、220r/min振摇过夜；次日按体积比1:100接种于含50μg/ml氨苄青霉素的30mlLB培养液中，33℃、220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，33℃、220r/min振摇4h，诱导表达目标蛋白HLA-F，10000r/min室温离心2min，弃上清，即得目标蛋白HLA-F包涵体。3.根据权利要求1所述的人HLA-F单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，对所述目标蛋白HLA-F包涵体进行变复性处理的具体操作如下：将所述目标蛋白HLA-F包涵体重悬于20ml裂解液，超声破碎后，4℃10000r/min室温离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液洗涤沉淀3次；用溶解缓冲液溶解沉淀，所述溶解缓冲液与所述沉淀的体积为10:1，4℃放置过夜，室温，10000r/min离心15min，得到上清液在搅拌条件下缓慢滴加至含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的缓冲液中，得到蛋白溶液装入透析袋于含20mMtris-HCl、0.15MNaCl且pH8.0的溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晶，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32