阻断型CD47纳米抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了阻断型CD47纳米抗体及其用途。具体地，本发明专利技术提供了一种针对整合素相关蛋白(CD47)的纳米抗体。具体而言，该抗体不仅能够特异结合人CD47，还能够有效阻断CD47与其配体SIRPa的相互作用。本发明专利技术同时公开了该抗体的编码序列及其用途，特别是在治疗和/或预防、或诊断CD47相关疾病例如肿瘤中的用途。

【技术实现步骤摘要】
阻断型CD47纳米抗体及其用途
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及一种针对整合素相关蛋白(CD47)分子胞外段的阻断型纳米抗体。还公开了其编码序列、相关制备方法及其用途，特别是在治疗和/或预防、或诊断CD47相关疾病例如肿瘤中的用途。
技术介绍
CD47也被称为整合素相关蛋白(integrin-associatedprotein，IAP)，是免疫球蛋白超家族中的重要成员，在不同组织细胞中均广泛表达。CD47的化学特性是一个50kD的膜糖蛋白，包含1个胞外类Ig可变结构域、5个高度疏水延伸的跨膜片段以及1个短选择性拼接的羧基端胞质尾区。CD47分子在集体中多重调控作用的发挥主要基于与信号调节蛋白a、血小板反应蛋白、及整合素间的相互作用，参与中性粒细胞、单核细胞和T细胞等免疫细胞跨膜迁移以及吞噬作用的调节。CD47与抑制性受体信号调节蛋白a互为受体和配体，可形成CD47-SIRPa信号复合体，该信号复合物具有介导双向信号调节并调控多种免疫反应进程的作用。在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等恶性肿瘤中，CD47高表达于肿瘤细胞表面，提示临床预后不良。肿瘤细胞通过借此“别吃我”信号，逃避了肿瘤免疫。然而，通过使用抗CD47抗体阻断CD47和SIRPa的相互作用具有靶向性治疗的效果。目前处于PhaseI的三个药物分别为FortySeven的Hu5F9-G4、Celgene的CC-90002以及Trillium的TTI-621。Trillium的CD47抗体项目为SIRPa-Fc融合蛋白，与Hu5F9-G4具有相类似的CD47亲和力(nM级别)。而SIRPa-Fc分子量更小约80kDa，相对于抗体分子的150kDa具有更好的穿透性和组织分布性；SIRPa-Fc对于红细胞的亲和力要远远低于Hu5F9-G4，表明其可能具有更好的安全性。传统单克隆抗体分子量较大、难以渗透进入组织间，并且单抗的生产周期长、人源化较为困难，因此，寻找具有更小分子量的抗体尤为重要。除抗原结合片段(Fab)、单链抗体(scFv)等基于传统单抗进行改造的小分子抗体外，在自然界骆驼科与鲨鱼科的体内存在一种天然的目前发现的最小抗原结合片段。这种抗体在1989年由布鲁塞尔自由大学Muyldermans等发现，他们在分离检测骆驼血清中的抗体时首次发现了一种重链抗体，该抗体缺失了两条轻链CL和恒定区CH1，仅由N端可变区(VHH)，铰链区和两个恒定区(CH1、CH2)构成，其可变区(VHH)即称为纳米抗体。纳米抗体分子量仅有约15kDa，其纳米级的分子大小和独特的结构赋予它优于传统抗体的多种特性，如稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等。纳米抗体因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体和小分子药物的优势，几乎完美地克服了传统抗体的开发周期长，稳定性低，保存条件苛刻等缺陷。这种分子量仅为常规抗体1/10的纳米抗体逐渐成为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量。因此应用纳米抗体技术研发CD47治疗性抗体药物具有广阔的前景。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供一种针对CD47胞外段的纳米抗体，该纳米抗体能够阻断CD47与其配体SIRPa的相互作用，同时提供该纳米抗体及其衍生物的编码序列、制备方法、及在诊断治疗中的用途。本专利技术的第一方面，提供了一种抗CD47纳米抗体的VHH链，所述VHH链包括互补决定区CDR，所述的互补决定区CDR包括SEQIDNO.:5所示的CDR1，SEQIDNO.:6所示的CDR2，和SEQIDNO.:7所示的CDR3(或由CDR1、CDR2和CDR3构成)。在另一优选例中，所述CD47为人CD47。在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与CD47高亲和力结合、阻断CD47与SIRPa相互作用的衍生序列。在另一优选例中，所述VHH链还包括框架区FR，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。在另一优选例中，所述的框架区FR由SEQIDNO.:1所示的FR1，SEQIDNO.:2所示的FR2，SEQIDNO.:3所示的FR3，和SEQIDNO.:4所示的FR4组成(或含有所述的FR1、FR2、FR3和FR4)。在另一优选例中，所述的抗CD47纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQIDNO.:8所示。此外，还提供一种抗人CD47抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3，并且3个CDR包括SEQIDNO.:5所示的CDR1，SEQIDNO.:6所示的CDR2，和SEQIDNO.:7所示的CDR3。本专利技术第二方面，提供了一种抗CD47纳米抗体，它是针对CD47表位的纳米抗体，并且具有如SEQIDNO.:8中所示的氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本专利技术第一方面所述的抗CD47纳米抗体的VHH链、或本专利技术第二方面所述的抗CD47纳米抗体。在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQIDNO.:9所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。本专利技术第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第三方面所述的多核苷酸。本专利技术第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本专利技术第三方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。本专利技术第六方面，提供了一种产生抗CD47纳米抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本专利技术第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗CD47纳米抗体的培养物；以及(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗CD47纳米抗体。在另一优选例中，所述的抗CD47纳米抗体具有如SEQIDNO.:8所示的氨基酸序列。本专利技术第七方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：(a)如本专利技术第一方面所述的抗CD47纳米抗体的VHH链、或如本专利技术第二方面所述的抗CD47纳米抗体；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本专利技术第一方面所述的抗CD47纳米抗体的VHH链、如本专利技术第二方面所述的抗CD47纳米抗体。在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本专利技术第一方面所述的抗CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗CD47纳米抗体的VHH链，其特征在于，所述VHH链包括互补决定区CDR，所述的互补决定区CDR包括SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，和SEQ ID NO：7所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种抗CD47纳米抗体的VHH链，其特征在于，所述VHH链包括互补决定区CDR，所述的互补决定区CDR包括SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，和SEQIDNO：7所示的CDR3。2.如权利要求1所述的VHH链，其特征在于，所述VHH链还包括框架区FR，所述的框架区FR由SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，和SEQIDNO：4所示的FR4组成。3.一种抗CD47纳米抗体，其特征在于，它是针对CD47表位的纳米抗体，并且具有如SEQIDNO.:8中所示的氨基酸序列的VHH链。4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的抗CD47纳米抗体的VHH链、或权利要求3所述的抗CD47纳米抗体。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，具有如SEQIDNO.:...

【专利技术属性】
技术研发人员：安康，安文琪，马小伟，范蓓，张宝献，潘若文，
申请(专利权)人：华兰生物工程股份有限公司，华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41