一种由基因组被编辑的CHO宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程与技术领域，涉及到一种由基因组被编辑的CHO宿主细胞用于产生的具有独特糖谱的重组抗体的方法。具体地，本发明专利技术的方法为采用TALEN技术，将已经适应无血清悬浮生长的CHO细胞的fut8基因进行编辑，被编辑的CHO宿主细胞能够产生具有独特糖谱的重组抗体，该独特糖谱主要体现在抗体具有非岩藻糖基化N‑连接寡糖链，N‑糖基化异质性程度极低，有均一的糖链。由本发明专利技术的方法制备得到的抗体ADCC效应显著增加，尤其突出的是，抗体稳定性增加。

【技术实现步骤摘要】
一种由基因组被编辑的CHO宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法
本专利技术属于生物工程与
，涉及到一种由基因组被编辑的CHO宿主细胞用于产生的具有独特糖谱的重组抗体及其该宿主细胞和抗体的制备方法。
技术介绍
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。CHO细胞容易发生基因突变，也较易进行基因转染。早期的研究也证明，与其他工程细胞株比较，用CHO细胞产生的抗体与人类血清抗体糖型最为接近，因此CHO细胞是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞。治疗性抗体的作用机制是与靶分子形成复合物，引起靶标抗原中和或者通过抗体Fc段的免疫效应清除抗原或者病原体。抗体药物与靶分子的特异性结合和活性作用的发挥依赖其复杂的多级结构和翻译后修饰，而糖基化作为抗体最重要的翻译后修饰，对于抗体的生物活性、体内代谢和免疫原性有着重要的作用。抗体药物的糖基化形式主要为N-糖基化，涉及的单糖主要有：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖、唾液酸(NANA、NGNA)。根据末端半乳糖数量，抗体分子Fc段Asn297连接的二分支或多分枝双触角复合型寡糖可分为G0、G1(1，3)、G1(1，6)和G2等多种类型，每一种类型又根据是否具有岩藻糖(F)或者平分型半乳糖(B)分为16种(Glycobiology,August2015,1-10.DOI:10.1093/glycob/cwv065)。因此，即使不考虑末端是否存在唾液酸化和高甘露糖型，抗体重链的寡糖类型至少有36种，且随着抗体两条重链的随机组合，可能存在的糖型达400多种，使抗体呈现出高度的异质性。不同糖型对治疗性抗体的药学性质有不同的影响。高甘露糖糖型(Man5)含量，导致抗体在血液中的快速清除，半衰期缩短(MAbs，2012，4(4):509－520)。G0F促进补体通路作用，加快清除速率。G2F在孕妇和新生儿脐带中含量增加。唾液酸修饰对静脉注射免疫球蛋白的炎症作用影响明显。岩藻糖的降低导致ADCC活性明显增强(JBC(2003)Chemistry278,3466-3473)。因此，根据治疗性抗体的主要作用机制和药物用途，设计和优化抗体的糖链是有必要的。与蛋白合成不同，抗体的糖基化并没有模板可遵循，其糖基化类型和各寡糖组分的比例受到宿主细胞类型及培养条件的影响。通过工程化宿主细胞来改造单克隆抗体的寡糖组分增强其Fc介导的效应的方法散见于不同的文献、专利报道。例如用β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)过表达的CHO细胞制备的抗体表现出比亲本细胞中表达的抗体更高的ADCC活性，而且活性的差异大约为10到20倍(BiotechnolBioeng.(2001)Aug20；74(4):288-94)，但GnTIII的过度表达对于CHO细胞有毒性并且由于是外源表达往往随着培养过程中传代次数增加，GnTIII表达量会下降，用此作为宿主细胞产生的抗体的岩藻糖含量会变化，从而影响抗体药物的均一性。产生脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子还包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripkaetal.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)，但由于其极低的蛋白产量不适合作为治疗性抗体生产的宿主细胞(YutakaKandaetalBiotechnolBioeng.(2006)Jul5；94(4):680-8)。α-1-6岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnukietal.(2004),Biotech.Bioeng.87:614)也导致生产的抗体岩藻糖含量降低。在如Yamane-Ohnuki和KyowaHakko专利所述的FUT8敲除细胞系中，公开了一种控制抗体岩藻糖化水平和提高ADCC(抗体依赖性细胞毒性)效应的方法，该方法就是用特异的siRNA抑制宿主细胞中fut8基因的表达从而降低该宿主细胞所生产抗体的岩藻糖水平，该方法与前述GnTIII过度表达的CHO细胞系有一样的缺点，首先宿主细胞需要引入外源序列，其次siRNA抑制目的基因的效率最多只能到70％左右，最后siRNA表达的稳定性可能影响抗体药物的质量属性。最近，利用新兴的基因组编辑技术对宿主细胞目的基因进行编辑，失活胞内的FUT8酶，降低抗体的岩藻糖水平在不同的文献、专利中屡有报道。如Malphettesetal(2010)报道了采用锌指酶(ZFN)技术敲除亲本细胞DG44，得到fut8基因纯合敲除的DG44衍射生克隆，用该细胞系生产的抗体完全不含岩藻糖。Beurdeleyetal(2012)报道了采用TALEN技术对CHO-K1细胞的fut8基因进行编辑，使宿主细胞丧失FUT8酶活性；再如Sunetal(2015)报道了用CRISPR/Cas9技术对fut8基因的10号外显子编辑，使CHO-K1细胞丧失FUT8酶活性。
技术实现思路
基于此，有必要针对现有抗体药物基本限于Fc的单一N-糖基化修饰，但因糖型组分和含量不一致且易变化而影响生产稳定性等问题，提供一种由基因组被编辑的CHO宿主细胞产生的具有独特糖谱的抗体以及该抗体的制备方法。本专利技术的上述目的通过以下的技术手段实现：第一方面，本专利技术提供一对多肽，具有SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的氨基酸序列，或者与SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。在一些实施例中，SEQ.NO.10和SEQ.NO.11所示的一对多肽分别为TALEN的上游和下游的DNA结合域的氨基酸序列，其可以特异地与基因的特定碱基区域结合。第二方面，本专利技术提供了一对多核苷酸，该一对核苷酸分别编码SEQ.NO.10和SEQ.NO.11所示的一对多肽。在一些实施例中，所述的一对多核苷酸具有SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所示的核酸序列，或者与SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。第三方面，本专利技术提供了一对融合蛋白，该融合蛋白由上述的一对多肽与转录激活子样效应因子(FokI)的DNA切割域的氨基酸序列融合而成。在一些实施例中，转录激活子样效应因子(FokI)的DNA切割域的氨基酸序列为天然的或者经过人工改造的。在一些实施例中，所述的一对融合蛋白具有如SEQIDNO.14和SEQIDNO.16所示氨基酸序列，或者与SEQIDNO.14和SEQIDNO.16所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一对多肽，其特征在于，具有SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。

【技术特征摘要】
2017.08.11 CN 20171068788991.一对多肽，其特征在于，具有SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的氨基酸序列，或者与SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。2.一对多核苷酸，其特征在于，所述的一对多核苷酸分别编码如权利要求1所述的一对多肽；优选地，所述的一对多核苷酸序列分别如SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所示，或者与SEQIDNO.12和SEQIDNO.13所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。3.一对融合蛋白，其特征在于，所述的一对融合蛋白由权利要求1所述的一对多肽分别与天然的或经过人工改造的FokI的DNA切割域融合而成；优选地，所述的一对融合蛋白氨基酸序列分别如SEQIDNO.14和SEQIDNO.16所示，或者与SEQIDNO.14和SEQIDNO.16所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。4.一对多核苷酸，其特征在于，分别编码如权利要求3所述的一对融合蛋白；优选地，所述的多核苷酸序列分别如SEQIDNO.15和SEQIDNO.17所示，或者与SEQIDNO.15和SEQIDNO.17所示序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。5.一种包含权利要求2、4任一所述的一对多核苷酸中的至少任意一条多核苷酸的载体；优选地，所述的载体为质粒。6.一种用权利要求5所述载体转染的宿主细胞；优选地，所述的宿主细胞为CHO；更优选地，所述的CHO细胞为CHO-K1；更优选地，所述的CHO-K1适应无血清培养；优选地，所述的宿主细胞用于表达抗体；更优选的，所述的宿主细胞用于表达具有独特糖谱的抗体；优选地，所述的独特糖谱与野生型糖谱比较，至少一种糖部分的水平发生变化；优选地，所述的糖部分选自葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、高甘露糖、葡萄糖胺、G0或乙酰葡萄糖胺；优选地，所述的抗体的糖部分满足以下条件中的一种或多种：a.所述的抗体岩藻糖的水平降低；优选地，所述的岩藻糖水平小于等于5％；更优选地，所述的岩藻糖水平为0；b.所述的抗体甘露糖的水平降低；优选地，所述的甘露糖含量小于等于5％；c.所述的抗体高甘露糖的水平降低；优选地，所述的高甘露糖含量小于等于5％；d.所述的抗体半乳糖的水平降低；优选地，所述的半乳糖的水平小于等于30％；更优选地，半乳糖水平小于等于5％；e.所述的抗体G0含量升高；优选地，所述的G0含量大于等于60％；更优选地，所述的G0水平大于等于80％；优选地，所述的G0含量大于等于60％，不含岩藻糖；更优选地，G0含量大于等于60％，不含岩藻糖，同时甘露糖含量小于等于5％或/和含高甘露糖含量小于等于5％；优选地，所述的抗体具有如说明书附图10中所示的糖谱；优选地，所述的抗体为抗EGFR或CD20或Trop2抗体；更优选地，所述的抗体为人源化或者全人源抗CD20抗体；优选地，所述的抗体为BAT1206F；更优选地，所述的抗体BAT1206F具有两条SEQIDNO.18所示的轻链和两条SEQIDNO.19所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT4406F；更优选地，所述的抗体BAT4406F具有两条SEQIDNO.22所示的轻链和两条SEQIDNO.23所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT4306F；更优选地，所述的抗体具有两条SEQIDNO.20所示的轻链和两条SEQIDNO.21所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT0206F；更优选地，所述的抗体BAT0206F具有两条SEQIDNO.24所示的轻链和两条SEQIDNO.25所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT0808；更优选地，所述的抗体BAT0808具有两条SEQIDNO.26所示的轻链和两条SEQIDNO.27所示的重链。7.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的一对多肽中的至少任意一条；或者优选地，含有权利要求2所述的一对多核苷酸中的至少任意一条；或者优选地，含有权利要求3中所述的一对融合蛋白中的至少任意一个；或者优选地，含有权利要求4中所述的一对多核苷酸中的至少任意一条；或者优选地，含有权利要求5中所述的载体；或者优选地，含有权利要求6中所述的宿主细胞。8.权利要求1-5任一所述的一对多肽/一对多核苷酸/一对融合蛋白/一对多核苷酸/载体在CHO细胞的Fut8基因编辑中的应用。9.权利要求1-6任一所述的一对多肽/一对多核苷酸/一对融合蛋白/一对多核苷酸/载体/宿主细胞在生产抗体中的应用或其所生产的抗体；优选地，所述的抗体具有独特糖谱；更优选地，所述的独特糖谱为与野生型糖谱比较，至少一种糖部分的水平发生变化；优选地，所述的糖部分选自葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、高甘露糖、葡萄糖胺、G0或乙酰葡萄糖胺；优选地，所述的抗体的糖部分满足以下条件中的一种或多种：a.所述的抗体岩藻糖的水平降低；优选地，所述的岩藻糖水平小于等于5％；更优选地，所述的抗体岩藻糖水平为0；b.所述的抗体甘露糖的水平降低；优选地，所述的甘露糖含量小于等于5％；c.所述的抗体高甘露糖的水平降低；优选地，所述的高甘露糖含量小于等于5％；d.所述的抗体半乳糖的水平降低；优选地，所述的半乳糖的水平小于等于30％；更优选地，半乳糖水平小于等于5％；e.所述的抗体G0含量升高；优选地，所述的G0含量大于等于60％；更优选地，所述的G0水平大于等于80％；优选地，所述的抗体G0含量大于等于60％，不含岩藻糖；更优选地，G0含量大于等于60％，不含岩藻糖，同时甘露糖含量小于等于5％或/和含高甘露糖含量小于等于5％：优选地，所述的抗体具有如说明书附图10中所示的糖谱；优选地，所述的抗体结合EGFR或CD20或Trop2；更优选地，所述的抗体结合CD20；更优选地，所述的抗体为人源化或者全人源抗CD20抗体；优选地，所述的抗体为BAT1206F；更优选地，所述BAT1206F抗体具有两条SEQIDNO.18所示的轻链和两条SEQIDNO.19所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT4406F；更优选地，所述的抗体BAT4406F具有两条SEQIDNO.22所示的轻链和两条SEQIDNO.23所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT4306F；更优选地，所述的抗体BAT4306F具有两条SEQIDNO.20所示的轻链和两条SEQIDNO.21所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT0206F；更优选地，所述的抗体BAT0206F具有两条SEQIDNO.24所示的轻链和两条SEQIDNO.25所示的重链；优选地，所述的抗体为BAT0808；更优选地，所述的抗体BAT0808具有两条SEQIDNO.26所示的轻链和两条SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦超，周远清，萧翠珍，
申请(专利权)人：百奥泰生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44