人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)采集健康胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；(2)对所述胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；(3)将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。得到的冻干粉具有良好的外观性状。其溶解性较好，动物实验证明其刺激性小，安全性高，使用可靠，并具有较好的生物活性，可用于创伤修复、皮肤护理和皮肤再生。该制备方法操作简单有效，能够实现人胎盘干细胞提取物冻干粉的产业化利用。

Preparation and Application of Freeze-dried Powder of Human Placental Stem Cell Extract

The invention relates to a method for preparing freeze-dried powder of human placental stem cell extract, which comprises the following steps: (1) collecting healthy placenta, extracting and separating the placental stem cells; (2) subculturing the placental stem cells and isolating the placental stem cell extract; (3) mixing the placental stem cell extract with the freeze-dried protectant, freezing-drying the placental stem cell extract. To placental stem cell extract freeze-dried powder. The freeze-dried powder has good appearance. Its solubility is good. Animal experiments prove that it has low irritation, high safety, reliable use, and good biological activity. It can be used for wound repair, skin care and skin regeneration. The preparation method is simple and effective, and can realize the industrial utilization of freeze-dried powder of human placental stem cell extract.

【技术实现步骤摘要】
人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，以及该冻干粉的应用。
技术介绍
干细胞(stemcell，SC)是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞。根据分化能力可分为胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)和成体干细胞(adultstemcells，ASCs)。胚胎干细胞即全能型干细胞，在分化能力上最具研究价值。但其来源于胚胎，势必存在着伦理方面和安全性方面的问题，所以胚胎干细胞在应用上受到了限制。然而，胎盘的采集简便易行，不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。过去胎盘通常作为废物丢弃，而从胎盘中提取干细胞进行保存，是宝贵的生命资源再生。在分离出的胎盘干细胞中含有：胎盘间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞和胎盘造血干细胞三类干细胞。新生儿降生之时，一般可通过三种渠道获得干细胞：第一种为脐带内血液源采集造血干细胞；第二种为脐带自身内采集脐带源间充质干细胞；第三种为胎盘源采集胎盘干细胞。胎盘干细胞在临床应用前景中，存在举足轻重的作用。在自体器官修复、克隆移植，美容，遗传类疾病治疗，及心脏病、肝病、糖尿病等领域具有无限前景。干细胞提取物一般是指干细胞培养液的上清液或细胞裂解液。其细胞培养液上清液含有大量的具有多种生物活性的蛋白质、多肽及细胞因子，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。因此，随着干细胞提取物的应用价值越来越受到人们的关注，如何获得大量的，质量稳定可控的干细胞提取物成为人们致力研究的问题。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法。本专利技术的第二目的在于提供该冻干粉的应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；(2)对所述胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；(3)将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。优选地，步骤(1)中，在无菌条件下，将健康的胎盘剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞。优选地，步骤(1)中，对胎盘进行以下处理：(i)将所述胎盘加入到含有0.1％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.03％EDTA的溶液中，在37℃下处理0.5～1.5h；(ii)将所述胎盘取出后，剪碎至1～3mm3的块体，并用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗；(iii)将胎盘块体加入到含有1～2g/L胶原酶Ⅱ、0.04～0.05g/LDNaseⅠ和8％～10％胎牛血清的DMEM消化液的溶液中，在37℃下处理1～3h；(iiii)对步骤(iii)得到的液体离心后，弃去上层清液得到培养物，然后接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养。优选地，所述双抗为青霉素和链霉素，所述磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液。优选地，青霉素在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。优选地，步骤(2)中，对所述胎盘干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为胎盘干细胞提取物。优选地，步骤(3)中，将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后冷冻干燥，得到胎盘干细胞提取物冻干粉。优选地，所述冻干保护剂为海藻糖和/或牛血清白蛋白，其在所述胎盘干细胞提取物冻干粉中的质量百分含量为5％～10％。优选所述冻干保护剂中，海藻糖与牛血清白蛋白的质量比为(5～10)：1。优选地，所述冷冻干燥的操作过程为：在-80℃下预冻10～15h，然后在-30℃下保温1～2h，接着在-5℃，真空度为1.0×10-2～1.5×10-2mbar条件下冻干10～15h。本专利技术还涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉，其通过上述方法制备得到。本专利技术还涉及所述冻干粉的应用，所述冻干粉用于创伤修复、皮肤护理和皮肤再生。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，该方法采用海藻糖或牛血清白蛋白作为冻干保护剂，得到的冻干粉具有良好的外观性状。其溶解性较好，动物实验证明其刺激性小，安全性高，使用可靠，并具有较好的生物活性，可用于创伤修复、皮肤护理和皮肤再生。该制备方法操作简单有效，能够实现人胎盘干细胞提取物冻干粉的产业化利用。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。本专利技术实施例涉及一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；(2)对胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；(3)将胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，在无菌条件下，将健康的人胎盘剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞。在本专利技术的一个实施例中，双抗为青霉素和链霉素。磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液，其pH值为7.2～7.4，含有NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L。青霉素在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。在本专利技术的一个具体实施例中，步骤(1)中，在无菌条件下，挑取新鲜健康的胎盘，剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗3～5次；接着用无菌的眼科镊子夹取胎盘，接种于含有双抗的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下进行培养。每隔2-3天更换新鲜的培养基，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞。在本专利技术的一个具体实施例中，由于胎盘含有大量的肌肉和脂肪组织，为了使干细胞更好地溶出，需要将胎盘剪碎后，采用消化液对其进行处理。具体步骤如下：(i)将胎盘加入到含有0.1％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.03％EDTA的溶液中，在37℃下处理0.5～1.5h；(ii)将胎盘取出后，剪碎至1～3mm3的块体，并用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗；(iii)将胎盘块体加入到含有1～2g/L胶原酶Ⅱ、0.04～0.05g/LDNaseⅠ和8％～10％胎牛血清的溶液中，在37℃下处理1～3h；(iiii)对步骤(iii)得到的液体离心后，弃去上层清液得到培养物，然后接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养。在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，对胎盘干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为胎盘干细胞提取物。在本专利技术的一个具体实施例中，步骤(2)中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；(2)对所述胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；(3)将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集健康的胎盘，进行提取和分离后得到胎盘干细胞；(2)对所述胎盘干细胞进行传代培养，分离得到胎盘干细胞提取物；(3)将所述胎盘干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到胎盘干细胞提取物冻干粉。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在无菌条件下，将健康的胎盘剪碎至1～3mm3的块体，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代胎盘干细胞；优选地，对所述胎盘进行以下处理：(i)将所述胎盘加入到含有0.1％～0.3％的胰蛋白酶和0.01％～0.03％EDTA的溶液中，在37℃下处理0.5～1.5h；(ii)将所述胎盘取出后，剪碎至1～3mm3的块体，并用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗；(iii)将胎盘块体加入到含有1～2g/L胶原酶Ⅱ、0.04～0.05g/LDNaseⅠ和8％～10％胎牛血清的溶液中，在37℃下处理1～3h；(iiii)对步骤(iii)得到的液体离心后，弃去上层清液得到培养物，然后接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双抗为青霉素和链霉素，所述磷酸盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：程文海，
申请(专利权)人：广州苿莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44