毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)采集人的毛发，进行提取和分离后得到毛囊干细胞；(2)对所述毛囊干细胞进行传代培养，分离得到毛囊干细胞提取物；(3)将所述毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到毛囊干细胞提取物冻干粉。得到的冻干粉具有良好的外观性状。其溶解性较好，动物实验证明其刺激性小，安全性高，使用可靠，并具有较好的生物活性，可用于创伤修复、皮肤再生和头发再生。该制备方法操作简单有效，能够实现毛囊干细胞提取物冻干粉的产业化利用。

Preparation and application of freeze-dried powder of hair follicle stem cell extract

The invention relates to a method for preparing freeze-dried powder of hair follicle stem cell extract, which comprises the following steps: (1) collecting human hair, extracting and separating hair follicle stem cells; (2) subculturing the hair follicle stem cells and isolating the hair follicle stem cell extract; (3) extracting the hair follicle stem cells. After mixing with freeze-drying protectant, freeze-drying powder of hair follicle stem cell extract was obtained. The freeze-dried powder has good appearance. Its solubility is good. Animal experiments prove that it has low irritation, high safety, reliable use and good biological activity. It can be used for wound repair, skin regeneration and hair regeneration. The preparation method is simple and effective, and can realize the industrial utilization of freeze-dried powder of hair follicle stem cell extract.

【技术实现步骤摘要】
毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，以及该冻干粉的应用。
技术介绍
干细胞(stemcell，SC)是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的原始细胞。根据分化能力可分为胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)和成体干细胞(adultstemcells，ASCs)。胚胎干细胞即全能型干细胞，在分化能力上最具研究价值。但其来源于胚胎，势必存在着伦理方面和安全性方面的问题，所以胚胎干细胞在应用上受到了限制。成体干细胞虽在分化能力上弱于胚胎干细胞，但其避开了伦理方面和安全性方面的问题，且自身成体干细胞移植还可解决免疫排斥问题，避免了长期应用免疫抑制剂所造成的伤害，所以在临床应用上，成体干细胞优于胚胎干细胞。成体干细胞主要存在于能自我更新的组织和器官中，皮肤组织更新和再生能力强，而毛囊作为其附属器官，终身保持着周期性生长和自我更新的能力。研究表明，毛囊是目前为止存在于胚胎组织之外唯一的类胚胎组织，兼有胚胎干细胞和成体干细胞的优点。毛囊中存在着大量多潜能干细胞，可经体外诱导分化为平滑肌细胞、神经元细胞、神经胶质细胞和黑色素细胞等。所以毛囊干细胞(hairfolliclestemcells，HFSC)的研究越来越受到人们的关注。毛囊属于皮肤的附属成分，是由表皮下陷形成的。由上皮性毛根鞘及结缔组织鞘所构成，位于毛发的下段并且包围着毛根。毛囊上附有立毛肌，并与皮脂腺相连，同时汗腺也开口于毛囊。上皮性毛根鞘的细胞起源于表皮，结缔组织鞘起源于真皮。上皮性毛根鞘是由皮肤的表皮层下凹深入真皮、皮下脂肪层而成，作为表皮的延续部分而包绕毛发，由内向外依次分为鞘小皮、内根鞘和外根鞘，外根鞘相当于表皮的基底层和棘细胞层。在毛干上部外毛根鞘细胞增殖，并且形成隆起，成为毛发上段的标记，目前被认为是毛囊干细胞存在的主要部位。毛囊干细胞可能是表皮细胞的祖细胞，对各种皮肤疾病的细胞代替治疗和基因治疗方面的研究有重要意义。干细胞提取物一般是指干细胞培养液的上清液或细胞裂解液。其细胞培养液上清液含有大量的具有多种生物活性的蛋白质、多肽及细胞因子，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。因此，随着干细胞提取物的应用价值越来越受到人们的关注，如何获得大量的，质量稳定可控的干细胞提取物成为人们致力研究的问题。目前已存在将胎盘干细胞制成冻干粉的报道，但关于毛囊干细胞的提取和研究还在起步中。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法。本专利技术的第二目的在于提供该冻干粉的应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术涉及一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)采集人的毛发，进行提取和分离后得到毛囊干细胞；(2)对所述毛囊干细胞进行传代培养，分离得到毛囊干细胞提取物；(3)将所述毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到毛囊干细胞提取物冻干粉。优选地，步骤(1)中，在无菌条件下，剪取头发毛囊根部，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代毛囊干细胞。优选地，所述双抗为青霉素和链霉素，所述磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液。优选地，步骤(2)中，对所述毛囊干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为毛囊干细胞提取物。优选地，步骤(3)中，将所述毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后冷冻干燥，得到毛囊干细胞提取物冻干粉。优选地，所述冻干保护剂为海藻糖和/或牛血清白蛋白，其在所述毛囊干细胞提取物冻干粉中的质量百分含量为5％～10％。优选所述冻干保护剂中，海藻糖与牛血清白蛋白的质量比为(5～10)：1。优选地，所述冷冻干燥的操作过程为：在-80℃下预冻10～15h，然后在-30℃下保温1～2h，接着在-5℃，真空度为1.0×10-2～1.5×10-2mbar条件下冻干10～15h。本专利技术还涉及一种毛囊干细胞提取物冻干粉，其通过上述方法制备得到。本专利技术还涉及所述冻干粉的应用，所述冻干粉用于创伤修复、皮肤再生和头发再生。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，该方法采用海藻糖或牛血清白蛋白作为冻干保护剂，得到的冻干粉具有良好的外观性状。其溶解性较好，动物实验证明其刺激性小，安全性高，使用可靠，并具有较好的生物活性，可用于创伤修复、皮肤再生和头发再生。该制备方法操作简单有效，能够实现毛囊干细胞提取物冻干粉的产业化利用。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。本专利技术实施例涉及一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)采集人的毛发，进行提取和分离后得到毛囊干细胞；(2)对毛囊干细胞进行传代培养，分离得到毛囊干细胞提取物；(3)将毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到毛囊干细胞提取物冻干粉。在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，在无菌条件下，剪取头发毛囊根部，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代毛囊干细胞。在本专利技术的一个实施例中，双抗为青霉素和链霉素。磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液，其pH值为7.2～7.4，含有NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L。在本专利技术的一个具体实施例中，步骤(1)中，在无菌条件下，挑取毛乳头完整的毛发，剪取毛囊根部，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗3～5次；接着用无菌的眼科镊子夹取毛囊，接种于含有双抗的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下进行培养。每隔2-3天更换新鲜的培养基，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代毛囊干细胞。在本专利技术的一个实施例中，步骤(2)中，对毛囊干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为毛囊干细胞提取物。在本专利技术的一个具体实施例中，步骤(2)中，将获得的原代毛囊干细胞以0.1×105～1.0×105个细胞/cm2的密度接种于细胞培养皿中，加入新鲜的含有双抗的无血清培养基，在37℃，5％CO2的条件下进行培养。至培养得到第3～18代的细胞时，将含有毛囊干细胞的培养基加水配成悬液，转移至离心管中，以800～1000转/分钟的速度离心3～6分钟。离心结束后取上清液，得到毛囊干细胞提取物。在本专利技术的一个实施例中，步骤(3)中，将毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后冷冻干燥，得到毛囊干细胞提取物冻干粉。在本专利技术的一个实施例中，冻干保护剂为海藻糖和/或牛血清白蛋白(BSA)，其在毛囊干细胞提取物冻干粉中的质量百分含量为5％～10％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集人的毛发，进行提取和分离后得到毛囊干细胞；(2)对所述毛囊干细胞进行传代培养，分离得到毛囊干细胞提取物；(3)将所述毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到毛囊干细胞提取物冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种毛囊干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)采集人的毛发，进行提取和分离后得到毛囊干细胞；(2)对所述毛囊干细胞进行传代培养，分离得到毛囊干细胞提取物；(3)将所述毛囊干细胞提取物与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到毛囊干细胞提取物冻干粉。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在无菌条件下，剪取头发毛囊根部，用含有双抗的磷酸盐缓冲溶液冲洗后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为80％～90％时，即得到原代毛囊干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双抗为青霉素和链霉素，所述磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，对所述毛囊干细胞进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，即为毛囊干细胞提取物。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：程文海，
申请(专利权)人：广州苿莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44