【技术实现步骤摘要】
OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种OPCML基因启动子甲基化水平的检测试剂盒及其应用，尤其用于MSRE结合MNAzymeqPCR检测卵巢癌患者外周血中OPCML基因启动子甲基化水平。
技术介绍
目前，卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌症死亡女性患者的3％。卵巢癌90％以上为上皮性卵巢癌，发病隐匿，临床确诊时约80％患者疾病已为晚期，预后差。晚期卵巢癌(FIGOⅡ-Ⅳ期)患者5年生存率仅为30～45％，而早期卵巢癌(FIGOⅠ期)患者5年生存率高达90％以上。因此，除积极寻找新的有效的治疗方式外，探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，研发新型卵巢癌早期诊断技术迫在眉睫。现有技术中尚无简便有效的、精确的、可常规用于卵巢癌早期诊断的检测方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌标志物，但仅有50～60％的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宫内膜异位囊肿等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特异性较差，卵巢癌阳性预测值仅有10％～35％。总体而言，对于血清CA125检测、经阴道超声探查等传...
【技术保护点】
1.一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，包括以下物质：(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；(b)OPCML基因的引物及探针组，序列为：
【技术特征摘要】
1.一种OPCML基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，包括以下物质：(a)酶切反应液(10μL/测试)，包括双蒸水7μL，10×BufferR2μL，Bsh1236I1μL；(b)OPCML基因的引物及探针组，序列为：其中：序列中大写字母为DNA序列，小写字母为RNA序列；(c)PCR工作液；(d)标准品1-5，浓度分别为7.0×107copies/mL、7.0×106copies/mL、7.0×105copies/mL、7.0×104copies/mL、7.0×103copies/mL。2.一种如权利要求1所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：(A)取患者血清10μL加入到酶切反应液中，轻轻混匀后37℃孵育16小时，标准品与血清同步处理；(B)取上述酶切DNA5μL加入到PCR工作液中，进行PCR检测；(C)结果判断：根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度，若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。3.一种如权利要求1所述的OPCM基因启动因子甲基化水平的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)亚硫酸氢盐处理后测序法检测卵巢癌组织中OPCML基因启动子的甲基化状态，具体为：(1-1)取卵巢癌组织标本20-25mg，用剪刀剪碎后放入1.5mL的离心管中，利用DNA抽提试剂盒抽提组织样本中的DNA，抽提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度，利用DNA修饰试剂盒修饰提取后的DNA，然后把修饰后的DNA溶解在20μLBufferTE中；(1-2)引物系列为：上游引物5'-GTTTTTTTTGTAGG-GGAAGT-3'，下游引物5'-CAACAACTCCATCCCTAACC-3'，产物长度243bp；对修饰后的DNA进行PCR扩增，反应体系25μL，包括：修饰后的DNA2μL，10×Buffer2.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，25mmol/LMgCl21μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5UTaq酶0.2μL，无菌蒸馏水16.3μL；循环条件：(1-3)利用PCR产物胶纯化试剂盒对步骤(1-2)取得的PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物与质粒连接，转化到感受态细菌中进行蓝白斑筛选，挑取10个白色阳性克隆进行测序，对测序结果与基因组序列进行比对，分析OPCML基因启动子的甲基化状态；(2)根据步骤(1)的分析结果确定扩增位置及设计引物，引物及探针系列包括：；(3)选取OPCML基因启动子甲基化阳性样本，制备标准品(3-1)在步骤(1-3)的测序确定阳性的标本中选取1个组织进行DNA提取；(3-2)将步骤(3-1)提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA的浓度和纯度；(3-3)对步骤(3-2)提取的DNA进行PCR扩增，引物为O...
【专利技术属性】
技术研发人员：周峰，曹兴建，陈相，
申请(专利权)人：南通市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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