一种从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术，具体说是一种从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的方法。水母刺丝囊提取液依次经过HiTrap Desalting凝胶过滤脱盐柱和Q Sepharose High Performance的阴离子交换树脂进行分离和纯化，得到纯化的硫氧还蛋白。本发明专利技术具快速、简便的特点，为获得硫氧还蛋白及其深入研究和应用提供了重要的指导和基础。

【技术实现步骤摘要】
一种从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的方法
本专利技术涉及生物技术，具体说是一种从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的方法。
技术介绍
水母是世界上最古老而神秘的生物之一，大约在6.5亿年前就已经存在于地球上。水母是一种胶质状的浮游动物(Gelatinouszooplankton)，包括四大类群：刺胞动物门(Cnidaria)的水螅水母类(Hydrozoans)、管水母类(Siphonophores)、钵水母类(Scyphozoans即：Truejellyfish)以及栉水母门的栉水母类(Ctenophores)。水母在我国分布很广，从广东、海南岛沿海一直到辽宁沿海均有分布。在我国海域已记录的水母约有400种，占全球已记录种类的10％左右。海洋水母种类繁多，数量巨大，遍布世界各个海域，是海洋浮游动物的重要组成部分，在海洋生物生态系统中占有重要地位。水母类的食性很广，几乎无选择地摄食一切可获得的浮游动物，还包括许多海洋动物的卵和幼虫(包括幼鱼)，甚至于同类相食。此外，水母类还需取食一定量的浮游植物和有机碎屑以满足其能量需求。霞水母属刺胞动物门(Cnidaria)，钵水母纲(Scyphomedusae)，旗口水母目(Semaeostomeae)，霞水母科(Cyaneidae)，在我国海域分布较广。水母含有丰富的生物活性成分，具有很好的食用和药用价值。自古以来，水母既能供人食用，又可入药为人治病，早在《本草纲目》中就有记载，如气味咸温，无毒，主治妇人劳损，积血带下，小儿风疾，丹毒和汤火伤等。但是，水母提取物中成分众多，并且某些组分之间的结构、性质非常相近，分离纯化难度大；第二，水母成分多数是蛋白类物质，具有热敏感性，容易受到温度等环境因素的影响而致使其活性降低甚至丧失，这就造成在分离纯化过程中易降解。第三，水母种类的不同，其生理结构以及体内所含的成分也存在较大的差异，这就致使不同种类水母活性成分的分离纯化工作难以直接效仿，对于不同蛋白的纯化，只能通过进行特异的实验条件才能获得。所以，水母中活性成分的分离纯化工作具有很大的挑战性和创新性。
技术实现思路
本专利技术的目的是一种从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种从水母刺丝囊提取液中分离氧还蛋白的方法，水母刺丝囊提取液依次经过HiTrapDesalting凝胶过滤脱盐柱和QSepharoseHighPerformance阴离子交换树脂进行分离和纯化，得到纯化的硫氧还蛋白。进一步的说：1)将霞水母刺丝囊提取液利用HiTrapDesalting凝胶过滤脱盐柱，经Tris-HCl作为缓冲液去除样品中大量的盐组分，收集蛋白吸收峰待用；2)步骤1)中所得蛋白样品，利用QSepharoseHighPerformance的阴离子交换树脂分离，依次采用Tris-HCl缓冲液A和含1MNaCl的Tris-HCl缓冲液B进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，浓缩后进行SDS-PAGE电泳测定和PMF肽指纹图谱鉴定，即获得纯化的硫氧还蛋白。所述步骤1)中洗脱液为pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱流速为3～10mL/min。所述步骤2)中所使用的洗脱液为pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl洗脱液A和含1MNaCl的pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl洗脱液B进行梯度洗脱，洗脱梯度为用10柱体积使洗脱液B的浓度由0％升高到20％，之后用3个柱体积使洗脱液B的浓度由20％升高至100％，流速为1～3mL/min。本专利技术所具有的的优点：1.本专利技术从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白，该方法为实验水母硫氧还蛋白的深入研究和开发利用提供了重要技术指导和基础。2.本专利技术提取过程中采用HiTrapDesalting凝胶过滤脱盐法和QSepharoseHighPerformance阴离子交换柱从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白，具有效率好和分辨率高等优点。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的霞水母刺丝囊提取液HiTrapDesalting26/10脱盐层析图；其中，UV_280代表紫外280nm的吸收，阴影部分代表霞水母蛋白样品洗脱峰；Cond代表电导。图2为本专利技术实施例1提供的QSepharoseHighPerformance的阴离子交换树脂分离层析图和SDS-PAGE电泳图；其中，UV_280代表紫外280nm的吸收，箭头处代表硫氧还蛋白洗脱峰；ConcB代表NaCl浓度。图3为本专利技术实施例1中提供的蛋白条带a肽指纹图谱鉴定结果图，代表鉴定到的肽段的得分情况。图4为本专利技术实施例1中提供的蛋白条带b肽指纹图谱鉴定结果图，代表鉴定到的肽段的得分情况。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的解释。实施例11)样品的脱盐预处理：霞水母刺丝囊细胞加入pH7.8,10mMTris-HCl缓冲液，冰浴条件下利用超声波进行破碎5min，其中，工作/间隙＝5s/15s；然后将霞水母刺丝囊提取液于2℃，10000rpm离心，20min，取上清并使用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤后待用；将滤液用HiTrapDesalting26/10凝胶过滤脱盐柱进行过滤，使用pH7.8,10mMTris-HCl作为缓冲液去除样品中大量的盐组分，流速为3ml/min收集蛋白吸收峰待用(参见图1)；2)QSepharoseHighPerformance的阴离子交换柱纯化①将上述收集的含蛋白吸收峰滤液利用QSepharoseHighPerformance16/10的阴离子交换柱进行纯化，纯化时依次采用pH7.8,10mMTris-HCl缓冲液A和含1MNaCl,pH7.810mMTris-HCl缓冲液B进行梯度洗脱，洗脱梯度为用10柱体积使洗脱液B的浓度由0％升高到20％，之后用3个柱体积使洗脱液B的浓度由20％升高至100％，流速1mL/min，收集各洗脱峰进行毒性检测，并进行SDS-PAGE电泳分析(参见图2)；②PMF肽指纹图谱鉴定：将SDS-PAGE电泳中蛋白条带切取后，用胰蛋白酶消化成肽段，然后20000rpm离心15min，取上清液10ul上样，纳升液相色谱仪HPLC进行分离，经过液相分离的肽段进入到串联ESI质谱仪进行测定和数据库分析参见图3和图4。质谱鉴定结果显示，SDS-PAGE电泳中的a条带和b条带均是来源于霞水母(Cyaneacapillata)的硫氧还蛋白(Thioredoxin)。硫氧还蛋白单体分子量在12kDa左右，其中，b条带是硫氧还蛋白的单体状态，而a条带则是硫氧还蛋白的多聚状态，(表1和表2)。表1为电泳中a条带的肽指纹图谱鉴定结果AccessionDescriptionMasstr|A0A059TE93|A0A059TE93_CYACPThioredoxinOS＝Cyaneacapillata11657表2为电泳中b条带的肽指纹图谱鉴定结果AccessionDescriptionMasstr|A0A059TE93|A0A059TE93_CYACPThioredoxinOS＝Cyaneacapillata11657实施例21)样品的脱盐预处理：霞水母刺丝囊细胞加入pH7.8,10mMTris-HCl缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从水母刺丝囊提取液中分离氧还蛋白的方法，其特征在于：水母刺丝囊提取液依次经过HiTrap Desalting凝胶过滤脱盐柱和Q Sepharose High Performance的阴离子交换树脂进行分离和纯化，得到纯化的硫氧还蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种从水母刺丝囊提取液中分离氧还蛋白的方法，其特征在于：水母刺丝囊提取液依次经过HiTrapDesalting凝胶过滤脱盐柱和QSepharoseHighPerformance的阴离子交换树脂进行分离和纯化，得到纯化的硫氧还蛋白。2.按权利要求1所述的从水母刺丝囊提取液中分离硫氧还蛋白的方法，其特征在于：1)将霞水母刺丝囊提取液利用HiTrapDesalting凝胶过滤脱盐柱，经Tris-HCl作为缓冲液去除样品中大量的盐组分，收集蛋白吸收峰待用；2)步骤1)中所得蛋白样品，利用QSepharoseHighPerformance的阴离子交换树脂分离，依次采用Tris-HCl缓冲液A和含1MNaCl的Tris-HCl缓冲液B进行梯度洗脱，收集各洗脱峰，浓缩...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣锋，李鹏程，于华华，刘松，邢荣娥，陈晓琳，王雪芹，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37