曼氏无针乌贼神经肽Y及其重组表达方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种曼氏无针乌贼神经肽Y及其重组表达方法和应用。该方法包括：(1)获得表达曼氏无针乌贼神经肽Y的重组基因，重组基因包括自5’端至3’端依次排列的分泌信号肽基因序列、神经肽Y基因序列及酶切修饰肽段基因序列；(2)将重组基因插入到骨架质粒中，获得重组质粒；(3)将重组质粒转染至宿主细胞中，获得转染细胞；(4)培养转染细胞，收集转染细胞培养液，获得曼氏无针乌贼神经肽Y。本申请首次将曼氏无针乌贼神经肽Y进行重组表达，实现曼氏无针乌贼神经肽Y的胞外分泌表达，并进而将重组表达的神经肽Y投喂或皮下注射给曼氏无针乌贼，显著提高了曼氏无针乌贼的摄食率，显著促进了曼氏无针乌贼的生长发育。

【技术实现步骤摘要】
曼氏无针乌贼神经肽Y及其重组表达方法和应用
本专利技术属于曼氏无针乌贼饲养
，具体涉及一种曼氏无针乌贼神经肽Y及其重组表达方法和应用。
技术介绍
曼氏无针乌贼(Sepiellajaponica)俗称墨鱼，属软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼超科、乌贼科、无针乌贼属。乌贼分布于中国东南沿海，俄罗斯、日本、朝鲜以及东南亚沿海，舟山海区是最重要的分布区，是世界上十分重要的经济种。乌贼肉味鲜美，风味独特，营养价值高，深受消费群体的喜爱，干品称“螟脯鲞”，产品畅销东南亚一带及我国沿海各地。目前曼氏无针乌贼人工养殖饵料研发困难较大，主要是因为曼氏无针乌贼对于糠虾、杂鱼等新鲜饵料的依赖性高，但糠虾、杂鱼等新鲜饵料不仅成本较高，而且储存和运输都不方便，给推广曼氏无针乌贼养殖带来较大影响。目前针对曼氏无针乌贼人工养殖饵料的研发基本上都在优化饵料配方，丰富配方种类方面努力。例如申请号为CN201710798826.0的中国专利技术专利申请公开了一种曼氏无针乌贼软颗粒饲料，该软颗粒饲料由以下重量百分比的原料加工而成：加工厂的大黄鱼、虾、蟹类的加工下脚料20-40％，鲜虾2-5％，鱼粉50-75％，卡拉胶粉末1-5％，多维1-2％，膨化剂1-2％，米糠2-4％，螺旋藻粉0.1-0.5％。这种饲料虽然能够为曼氏无针乌贼提供比较多样的营养元素，但其并不能解决曼氏无针乌贼对糠虾、杂鱼等新鲜饵料的依赖性高的问题，曼氏无针乌贼对上述种类的饲料的摄食率仍旧不高。众所周知，动物的摄食生长活动受神经内分泌调控影响，其中神经肽Y(NeuropeptideY，简称NPY)是重要的正向调控活性肽，可促进动物摄食、提升生长率。但目前还没有关于曼氏无针乌贼神经肽Y、以及重组表达曼氏无针乌贼神经肽Y的报道。
技术实现思路
本申请的专利技术目的是提供一种曼氏无针乌贼神经肽Y，本申请的另一专利技术目的是提供一种曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法。为实现上述专利技术目的，本申请的技术方案如下：一种曼氏无针乌贼神经肽Y，至少具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。一种曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法，包括以下步骤：(1)获得表达所述的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组基因，所述的重组基因包括自5’端至3’端依次排列的分泌信号肽基因序列、神经肽Y基因序列及酶切修饰肽段基因序列；(2)将所述的重组基因插入到骨架质粒中，获得重组质粒；(3)将所述的重组质粒转染至宿主细胞中，获得转染细胞；(4)培养所述的转染细胞，收集转染细胞培养液，获得转染细胞分泌的曼氏无针乌贼神经肽Y。本申请首次公开了曼氏无针乌贼神经肽Y的氨基酸序列，并将曼氏无针乌贼神经肽Y进行重组表达，实现曼氏无针乌贼神经肽Y的胞外分泌表达，并进而将重组表达的神经肽Y投喂或皮下注射给曼氏无针乌贼，显著提高了曼氏无针乌贼的摄食率，显著促进了曼氏无针乌贼的生长发育。为使神经肽Y一旦表达即拥有生物活性，本申请采用真核瞬时转染以重组表达曼氏无针乌贼神经肽Y的方法，具体地，本专利技术的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法，包括以下步骤：(1)获得表达所述的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组基因，所述的重组基因包括自5’端至3’端依次排列的分泌信号肽基因序列、曼氏无针乌贼神经肽Y基因序列及酶切修饰肽段基因序列；作为优选，所述的分泌信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。分泌信号肽的序列应当与步骤(3)中宿主细胞的特性对应，如此才有利于引导重组蛋白在宿主细胞中进行正确的蛋白修饰加工并最终分泌至细胞外。作为优选，所述的曼氏无针乌贼神经肽Y至少具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。曼氏无针乌贼神经肽Y前体肽的全长编码氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，而SEQIDNo.2所示的氨基酸序列则是曼氏无针乌贼神经肽Y的成熟肽；显然地，本申请中的曼氏无针乌贼神经肽Y基因序列可以是仅编码如SEQIDNo.2所示的成熟肽的基因序列，也可以同时编码除成熟肽以外的前体肽的部分或全部氨基酸序列。作为优选，所述的酶切修饰肽段具有酰胺化修饰位点和酶切位点。作为进一步优选，所述的酶切修饰肽段的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的N端含有酰胺化修饰位点和酶切位点，在酰胺化修饰位点和酶切位点下游含有与多肽稳定性及保护相关的肽段。重组设计的曼氏无针乌贼神经肽Y的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，经密码子优化后，并在基因序列两端设计限制性酶切位点及KOZAK序列，最终获得的重组基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。(2)将所述的重组基因插入到骨架质粒中，获得重组质粒；骨架质粒应当选用DNA双链质粒，且其组成也必须与宿主细胞类型匹配，含有成熟的复制起始位点、抗性标记基因、启动子序列、多克隆位点等基本组成。可以选用pCDNA3.1质粒等。(3)将所述的重组质粒转染至宿主细胞中，获得转染细胞；在转染试剂的作用下将重组质粒转染至宿主细胞中。(4)培养所述的转染细胞，收集转染细胞培养液，获得转染细胞分泌的曼氏无针乌贼神经肽Y。本申请还提供了所述的曼氏无针乌贼神经肽Y在促进曼氏无针乌贼生长发育中的应用。本申请提供了两种曼氏无针乌贼神经肽Y的应用方法：其一、将所述的曼氏无针乌贼神经肽Y制成溶液，将该溶液经皮下注射曼氏无针乌贼。作为优选，溶液中曼氏无针乌贼神经肽Y的浓度为5-20mM，优选为10-15mM，在曼氏无针乌贼体重在20-50g时开始注射，每3-4天注射一次直至采收，每次注射量为40-60μL。其二、将所述的曼氏无针乌贼神经肽Y拌入饵料中，投喂给曼氏无针乌贼。拌料投喂时，可以采用从转染细胞培养液中提纯(可以通过凝胶层析分离或者HPLC制备纯化获取)的曼氏无针乌贼神经肽Y，此时曼氏无针乌贼神经肽Y与饵料的质量比为1：(1000-10000)；也可以直接采用转染细胞培养液，使用时将细胞培养液低温浓缩1/5后喷洒至饵料中，混合均匀，浓缩后细胞培养液与饵料的质量比为1：(20-40)即可。直接将曼氏无针乌贼神经肽Y拌入饵料中投喂给曼氏无针乌贼时，每天投喂2-3次，每次投喂量为曼氏无针乌贼重量的2-5％即可。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本申请首次公开了曼氏无针乌贼神经肽Y的氨基酸序列，并将曼氏无针乌贼神经肽Y进行重组表达，从而使得曼氏无针乌贼神经肽Y能够分泌至胞外并用于促进曼氏无针乌贼的生长发育，使得曼氏无针乌贼神经肽Y能够显著提高曼氏无针乌贼对成品饲料(非新鲜饵料)的摄食率，从而促进曼氏无针乌贼的生长发育。附图说明图1为重组表达的曼氏无针乌贼神经肽Y激活曼氏无针乌贼神经肽Y受体表达细胞株后胞内cAMP浓度变化特征分析结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案做进一步详细说明。实施例1本实施例一种曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法，包括以下步骤：(1)设计并合成表达曼氏无针乌贼神经肽Y的重组基因申请人构建了曼氏无针乌贼的编码基因库，从基因库中筛选曼氏无针乌贼神经肽Y的编码基因(如SEQIDNo.7所示)，根据该编码基因预测曼氏无针乌贼神经肽Y前体肽的全长编码氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，本实施例从该全长编码氨基酸序列截取了如SEQIDNo.1所示的神经肽Y的成熟短肽，以及SEQIDNo.5所示氨基酸序列C端的酶切修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种曼氏无针乌贼神经肽Y，其特征在于，至少具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种曼氏无针乌贼神经肽Y，其特征在于，至少具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得表达所述的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组基因，所述的重组基因包括自5’端至3’端依次排列的分泌信号肽基因序列、曼氏无针乌贼神经肽Y基因序列及酶切修饰肽段基因序列；(2)将所述的重组基因插入到骨架质粒中，获得重组质粒；(3)将所述的重组质粒转染至宿主细胞中，获得转染细胞；(4)培养所述的转染细胞，收集转染细胞培养液，获得转染细胞分泌的曼氏无针乌贼神经肽Y。3.如权利要求2所述的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法，其特征在于，所述的分泌信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。4.如权利要求2所述的曼氏无针乌贼神经肽Y的重组表达方法，其特征在于，所述的酶切修饰肽段具有酰胺化修...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静文，王天明，宋伊敏，梁晶，陈旭，吕振明，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33