一种仿生医用成丝纤维蛋白的制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种成丝纤维蛋白的，其序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术在一个方面提供一种用于制备成丝纤维的蛋白片段的制备方法，所述的蛋白片段是序列为SEQ ID NO:1的扇贝足丝蛋白的160‑324位氨基；其序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术制备成丝纤维的蛋白在材料来源上采用基因工程法制备，成本低廉，绿色环保可大规模生产。本发明专利技术的蛋白基材料来源于海洋扇贝足丝，并在类似海水环境中聚合成形，对湿环境具有良好的适应性和稳定性。在医用材料领域具有较好的开发前景。在材料生物安全性上，海洋生物来源材料避免了陆地生物疾病传播的风险，经检验材料无细胞毒性，具有生物相容性好。

【技术实现步骤摘要】
一种仿生医用成丝纤维蛋白的制备及其应用
本专利技术属于医学材料制备
，具体涉及一种成丝纤维及其应用。
技术介绍
生物医用材料(BiomedicalMaterials)也称为生物材料(Biomaterials)，是一种能对机体的细胞、组织和器官进行诊断、治疗、替代、修复、诱导再生或增进其功能的特殊的功能材料。生物机体内含有大量的以水为基础的细胞外液，机体细胞组织更是始终处于由组织液，血浆和淋巴液组成的“湿”环境中。因此用于体内修复，封堵，支持材料首先必须具有良好的水下稳定性和溶胀性，更高层次上还要求优良的生物相容性和可控的生物降解吸收性。目前主要用于体内环境的热门研究材料主要包括一些细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)蛋白如胶原和弹性蛋白，多糖类如壳聚糖，海藻酸盐，透明质酸等材料。这些材料虽然有自身独特的应用优势但也伴随着许多的缺陷。例如天然的胶原蛋白水凝胶机械性能较弱，降解速度较快和容易引起免疫反应等缺点；天然透明质酸对强酸、强碱、热、自由基及透明质酸酶敏感稳定性差，容易发生降解；壳聚糖由于晶体结构紧密，无法溶于中性溶液和大多数有机溶剂，因而其应用受到极大限制。目前新型体内外“湿”环境应用材料的开发仍是目前研究热门领域。
技术实现思路
本专利技术提供一种成丝纤维蛋白的制备及其应用，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种扇贝足丝蛋白，包含有：1)序列为SEQIDNO:1的蛋白；2)从海洋扇贝足丝中获得的，与1)中的序列具有80％以上同源性，且具有1)中蛋白功能的蛋白；上述的2)中同源性，是指具有90％或以上的同源性，最优选为具有99％的同源性；本专利技术在一个方面提供一种用于制备成丝纤维的蛋白片段的制备方法，所述的蛋白片段是序列为SEQIDNO:1的扇贝足丝蛋白的160-324位氨基；其序列为SEQIDNO:2；本专利技术的序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的蛋白片段在制备临床医用材料中的应用；所述的临床医用材料，包括手术缝合线、导管、纤维类材料或组织工程支架材料；本专利技术还提供一种用于制备成丝纤维的蛋白液，是将序列为SEQIDNO:2；的蛋白溶解于六氟异丙醇(HFIP)中制成的；所述的蛋白液中蛋白的浓度，优选为150mg/mL。本专利技术制备成丝纤维的蛋白在材料来源上采用基因工程法制备，成本低廉，绿色环保可大规模生产。目前正在应用材料，包括如胶原，弹性蛋白和壳聚糖等多来源于从生物体及其产物中提取。这种方法制取原料昂贵，工艺繁琐复杂且大多都有污染。而且材料成形上为仿生“湿”环境成形，材料成形后在体内外“湿”环境形态结构稳定，溶胀性较低。胶原，壳聚糖等材料成形一般在有机试剂或无水环境中，在体内外“湿”环境应用时由于溶胀性原因形态结构会发生变化。由于Sbp5-2蛋白基材料来源于海洋扇贝足丝，并在类似海水环境中聚合成形，对湿环境具有良好的适应性和稳定性。在医用材料领域具有较好的开发前景。在材料生物安全性上，海洋生物来源材料避免了陆地生物疾病传播的风险，经检验材料无细胞毒性，具有生物相容性好。附图说明图1：Sbp5-2功能模块划分及克隆模块示意图；图2：RM6CT基因的扩增产物凝胶电泳图；图3：纯化后蛋白SDS-PAGE电泳图片：图4：RM6CT蛋白成纤维图片A为自然环境中扇贝足丝形态，B为RM6CT蛋白拉丝成形过程中的形态，C为RM6CT蛋白拉丝稳定后的人工丝形态。图5：RM6CT蛋白纤维溶胀率(左)和吸水率(右)检测结果图；图6：RM6CT蛋白纤维湿环境下光学纤维镜下形态观察。刚成丝15min(左)，成丝后48h(右)；图7：细胞毒性评估图。具体实施方式申请人发现，扇贝足丝长期浸泡的海水环境中包含较多的材料腐蚀因素如海水含盐量，温度，溶氧量，pH值，流速与波浪，海洋微生物等，在如此恶劣的环境，扇贝足丝依旧可以保持稳定的形态结构和力学性质。申请人认为扇贝足丝蛋白具有在体内外“湿”环境应用材料领域的开发潜力和价值。根据这些性质的初步研究分析Sbp5-2蛋白丝在临床医用材料等多个领域，包括手术缝合线、导管及纤维类材料的制备以及作为组织工程支架材料等。实施例1：Sbp5-2蛋白的筛选1、Sbp5-2全基因的克隆1.1结合质谱鉴定结果序列信息，设计RACE引物运用PrimerPremier5软件设计RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)Sbp-5-2的引物3’RACE引物：TCCCAACAATGGAGTATGTGAAGATGCTG、5’RACE引物：GCCTAGTGTAACAGTCATTCTCCAGCCAAG；1.2RNA抽提取刚切断足丝时足适应期(0-2h)、足丝分泌增长期(2-16h)以及足丝分泌平衡期(16-24h)的三只栉孔扇贝进行解剖后取其足，依照Hu等(2006)的方法抽提RNA并等量混匀。利用SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit(Clontech，CA，USA)，按照说明，构建5’RACE和3’RACE文库。1.3分别进行目的基因的3’和5’末端的克隆在PCR管中加入：混匀后置于PCR仪中按以下程序进行扩增：1.4切胶回收克隆测序用1％的琼脂糖凝胶进行检测后，1×TBE配制2％的低熔点琼脂糖胶，电泳缓冲液为1×TBE，将样品全部点到胶孔后，在100V电压下电泳45min，切胶产物用QIAquickGelExtractionKit进行标准纯化，产物溶于三蒸水中，与pMD18-T载体进行连接，转化到大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR，挑取目的片段插入成功的阳性克隆进行Sanger测序，利用Star对3’和5’末端序列进行拼接获得Sbp5-2目的基因cDNA全长序列，其氨基酸序列为SEQIDNO:1。MYAVYLFVAVFILPIILAANDECTSKGQCTALDGVTCVSLGQQRLEKCNTYTCRRSNNVLKYKIVKNLLKCKRPDGTSMDIGVGEKDETKCTTEICRRARNSDGTFTLTYREKPYGCPLTDGSCLLFGKRNKIRNENKCLDTTCTRRKNKKGQYISRLKNKYYGCPNNGVCEDAEATRNNSCTSYMCVLSKRRTLMKWEILKTGCKTDEGCKYDTDEWTDPDASSCVTRRCDVTFNPTDKTYNSVNRVARHGCRASNGTCYYNSETWLENDCYTRRCDVTTTDKGESMAAIKIESGICKDADGSCKGYGEAMQYRSGAATLNCVCDEAISTQGYPQGRPVCKSP实施例2：成丝纤维的制备一、RM6CT的克隆表达根据Sbp5-2氨基酸序列分析发现除去信号肽序列的部分具有多个以成对半胱氨酸形成的功能模块，以及不同于功能模块的C末端(CTerminal)序列。功能模块中包含众多的亲水性氨基酸经筛选选择C末端(CTerminal)序列后连接的六个功能模块的亚克隆RM6CT(氨基酸序列号：160-324)进行纯化表达。(图1)，所述的亚克隆RM6CT的序列为SEQIDNO:2；NKYYGCPNNGVCEDAEATRNNSCTSYMCVLSKRRTLMKWEILKTGCKTDEGCKYDTDEWTDPDASSCVTRRC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扇贝足丝蛋白，其特征在于，所述的扇贝足丝蛋白包含有：1)序列为SEQ ID NO:1的蛋白；2)从海洋扇贝足丝中获得的，与1)中的序列具有80％以上同源性，且具有1)中蛋白功能的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种扇贝足丝蛋白，其特征在于，所述的扇贝足丝蛋白包含有：1)序列为SEQIDNO:1的蛋白；2)从海洋扇贝足丝中获得的，与1)中的序列具有80％以上同源性，且具有1)中蛋白功能的蛋白。2.如权利要求1所述的扇贝足丝蛋白，其特征在于，所述的2)中同源性，是指具有90％或以上的同源性。3.如权利要求2所述的扇贝足丝蛋白，其特征在于，所述的2)中同源性位99％的同源性。4.一种用于制备成丝纤维的蛋白片段，其特征在于，所述的蛋白片段是序列为SEQIDNO:1的扇贝足丝蛋白的160-324位氨基；其序列为SEQIDNO:2。5.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟治，王硕硕，徐平平，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37