一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法技术

本发明专利技术属于甲壳类动物基因工程技术领域，公开了一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法,斑节对虾ALFpm10抗菌肽由132个氨基酸组成，分子量为15.3kDa，信号肽由27个氨基酸组成；ALFpm10抗菌肽的cDNA全长517个碱基，可由斑节对虾血细胞的总RNA中通过RT‑PCR克隆获得；ALFpm10抗菌肽可通过原核表达系统，与SUMO蛋白融合表达获得，由固相化学合成的方法获得。本发明专利技术的ALFpm10抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌、藻居芽孢杆菌等具有抑菌、杀菌作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点，显示其在水产养殖行业具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法
本专利技术属于甲壳类动物基因工程
，尤其涉及一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：近年来，我国渔业中的养殖和捕捞产量都跃居到了世界的前列，渔业经济发展十分迅速，水产养殖占到了全球养殖的70％。但是，随着我国水产养殖业精养、半精养等养殖模式的发展，集约化程度的日益提高，残饵、粪便、水生动植物尸体等富营养因子共存于一个水体，加之水源的污染和池塘自净与调节能力的降低，导致养殖水体中化学需氧量、生物耗氧量、氨氮、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，病原微生物种类和数量上升，养殖环境恶化导致鱼虾病害频频发生。目前，针对集约化养殖导致养殖动物病害频发的主要防治方法是使用抗生素和化学药物，尤其是抗生素的大量使用给食品安全及出口贸易带来了巨大安全隐患，同时导致耐药病原增多、环境污染加剧、生态风险升高等一系列问题。抗生素滥用问题在水产养殖业尤其严重，我国已成为世界上滥用抗生素最严重的国家之一，2015年我国抗生素总使用量估计约18.2万吨，其中约52％用于农业、养殖业。因此，为了保障人民群众的饮食健康，提高产品品质出口创汇，增加养殖户的经济效益，急需寻找一种解决病害频发的方法，开发出绿色、环保、无害、高效的抗生素替代品，实现科学养殖、生产绿色产品。抗菌肽(Antimicmbia1peptides，AMPs)是生物体合成的一类小分子防御多肽，在抗生素替代和绿色养殖中具有重要意义，它是动物免疫防御体系在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，能提高生物非特异免疫活性，杀死入侵的微生物，具有活性高、特异性强等特点。研究表明抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞，在快速杀菌的同时，不会导致脓毒症，同时具有中和内毒素、调节增加机体免疫力等特性，使其最有可能替代抗生素成为新一代相对安全的抗菌药物。直到1988年，年Takao和Shimonishi在鲎(Tachypleustridentatus)血细胞里首次发现海洋生物抗菌肽—鲎素(tachyplesin)。近年来在海洋鱼类中发现了更多的抗菌肽，有的抗菌肽具有极强的抗菌活性，如Nakamura等(1996)从豹鳎(Pardachirusmarmoratus)体内分离到的Pardaxin具有比蜂毒素更强的抗菌活性；Silphaduang和Noga等(2001)从杂交条纹鲈(Moronesaxatilis♂×M.chrysops♀)中分离出的Piscidin对多种鱼类致病菌包括多重耐药菌株格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)均有较强抑杀作用,随后人们发现该家族的抗菌肽对病毒、真菌乃至寄生虫也均有抑制作用。综上所述，现有技术存在的问题是：至今仍未获得能快速杀灭病毒、弧菌等高危病害菌的对虾抗菌肽。对虾属于非脊椎动物，关于它的基础研究比较薄弱，免疫机理尚不完全清楚，抗菌肽的种类及作用机理都在研究之中。虽然，对于对虾养殖技术、饲料等应用研究比较成熟，国内也形成了大规模的养殖产量，但是基础研究的欠缺导致对虾病害频繁发生且没有获得科学的理论指导，至今未获得具有高效杀菌活性且可应用于对虾病害防治的对虾抗菌肽。解决上述技术问题的难度和意义：对虾养殖业也是近年发展非常快，高密度养殖和水质恶化引发了大规模的虾病爆发,使海产养殖业遭受严重损失，虽然，国内许多学者在对虾病防治方面作了大量的工作,并取得进展,但如何防治虾病仍然是对虾养殖业的难题。研究发现对虾血细胞可以产生多种抗菌肽，是对虾防御病害的第一道防线。1997年Destoumieux等从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，其中3种具有抗真菌和抗细菌尤其是抗革兰氏阳性菌的活性，随后从中克隆得到一条虾抗菌肽，并证明该抗菌肽的主要合成部位是其血细胞。对虾的防御机制主要依赖血细胞的活动，可以通过吞噬外来物或合成抗菌物质来防御病害入侵。因此，源于对虾的抗菌肽具有以下优势：①生物安全性好，源于对虾自身的抗菌肽不会对对虾养殖以及水体环境造成危害；②效率高，能针对性抑杀危害对虾养殖的病菌；③可抑杀源于海洋的病菌，许多海洋细菌均能耐受高盐等胁迫，导致其他来源的抗菌肽对其抑杀效果不佳。本专利技术通过副溶血弧菌处理斑节对虾，刺激其血细胞合成抗菌肽，通过反复筛选获得具有抗菌活性的抗菌肽cDNA，通过原核表达或化学合成技术获得抗菌肽的蛋白分子，对金黄色葡萄球菌等致病菌起到抑杀作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点，将来可应用于水产养殖病害的防治，具有重要的经济价值和发展潜力。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10及其制备方法。本专利技术是这样实现的，一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10共132个氨基酸，分子量约为15.3kDa，氨基酸序列为：SEQIDNO：1。(本专利技术抗菌肽序列与现有对虾抗菌肽只有75％的同源性)。进一步，所述斑节对虾ALFpm10基因的cDNA序列SEQIDNO：4共有517个碱基，1-28及427-517为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQIDNO：2，共27个氨基酸。进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQIDNO：3。本专利技术的另一目的在于提供一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法包括：通过原核表达系统获得，将ALFpm10的基因序列连接到pET-28a、pColdIV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm10融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm10抗菌肽。进一步，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法进一步包括：通过固相化学法合成。进一步，ALFpm10的基因获得方法包括：斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理3h的斑节对虾血细胞，采用试剂盒提取血细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；根据ALFpm10的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC3'，获得约517bp的特异性cDNA片段，经测序得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，具体包括：1)斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取：血细胞的收集：先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟，用1mL抗血清洗涤细胞，即可用于后续的总RNA提取；总RNA的提取：采取RNeasyMiniKit提取斑节对虾的总RNA，吸取不超过1×107个细胞，5000rpm离心5min，去上清；加入BufferRLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10共132个氨基酸，分子量约为15.3kDa，氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10共132个氨基酸，分子量约为15.3kDa，氨基酸序列为：SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，所述斑节对虾ALFpm10基因的cDNA序列SEQIDNO：4共有517个碱基，1-28及427-517为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQIDNO：2，共27个氨基酸。3.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQIDNO：3。4.一种如权利要求1所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法包括：通过原核表达系统获得，将ALFpm10的基因序列连接到pET-28a、pColdIV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm10融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm10抗菌肽。5.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法进一步包括：通过固相化学法合成。6.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，ALFpm10的基因获得方法包括：斑节对虾先用溶血弧菌进行处理，收集处理3h的斑节对虾血细胞，采用试剂盒提取血细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；根据ALFpm10的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC3'，获得约517bp的特异性cDNA片段，经测序得到517bp的斑节对虾ALFpm10抗菌肽基因。7.如权利要求4所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm10的制备方法，具体包括：1)斑节对虾血细胞的收集和总RNA的提取：血细胞的收集：先用1毫升注射器吸入100微升抗凝剂插入斑节对虾的心包窦吸取600微升血淋巴液，1500rpm离心10分钟，用1mL抗血清洗涤细胞，即可用于后续的总RNA提取；总RNA的提取：采取RNeasyMiniKit提取斑节对虾的总RNA，吸取不超过1×107个细胞，5000rpm离心5min，去上清；加入BufferRLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的BufferRPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-freewater，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；2)抗菌肽cDNA序列的克隆：根据斑节对虾ALFpm10抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'GAGGCTATAAGATTTACGAGTGAAG3'，下游引物为5'AAGAGTAAATCTCGCACATAAATCC3'，采用RNeasyMiniKit提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王潮岗，周亮，李国强，胡章立，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44