一种固液相结合制备齐考诺肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。本发明专利技术包括如下步骤：（1）固液相结合制备带修饰的多肽片段A；（2）固相法制备多肽片段B；（3）通过自然链接法，在液相条件下将修饰的多肽片段A链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液；（4）在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。

【技术实现步骤摘要】
一种固液相结合制备齐考诺肽的方法
本专利技术涉及多肽化合物合成
，尤其涉及一种固液相结合制备齐考诺肽的方法。
技术介绍
齐考诺肽英文名称Ziconotide，是一种含有3个二硫键和25个氨基酸的多肽。分子式：C102H172N36O32S7，分子量：2639.13，序列和结构如式I所示式1齐考诺肽是一种非阿片类镇痛药物，适用于鞘内注射并且对其他治疗(如全身镇痛药、辅助治疗或鞘内注射吗啡)不能耐受或无效的严重慢性疼痛患者。齐考诺肽为含有3个二硫键和25个氨基酸的多肽。本品与位于脊髓背角浅层的初级伤害性传入神经上的N-型钙通道结合，抑制初级传人神经末梢兴奋性递质的释放，具有抗伤害感受作用。本品不与阿片受体结合，其药理作用也不被阿片受体拮抗剂所阻断。在动物模型中，本品可改变阿片引起的胃肠动力降低，但不能改善吗啡引起的呼吸抑制。给大鼠鞘内注射本品，同时给予吗啡、巴氯芬或可乐定，镇痛作用增强。本品与吗啡合用，不能防止大鼠对吗啡的耐受性。现有的齐考诺肽的制备方法合成周期长，生产成本高，产品收率低，不利于齐考诺肽的大规模生产。CN200710301598，CN201110139661，CN201610947996公开了三种不同的合成齐考诺肽的方法，都是逐一偶联25个不同保护的氨基酸，随着肽链的延伸，偶联难度的增加，会导致多肽粗品纯度降低，纯化困难，收率降低的问题。CN201310202089和CN20150421787公开了一种全保护片段合成齐考诺肽的方法，其中CN201310202089选择了3个两肽片段来避免残肽的产生，CN20150421787则选择了全保护片段B（12-18）、C（6-11）、D（1-5）逐一偶联到片段A（19-25）树脂上，此类片段合成法都需要过量的全保护片段，而且制备大量片段也会造成成本提高，不利于后期工业化放大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长，生产成本高，产品收率低不利于后期工业化放大的技术问题。为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，包括如下步骤：1.固液相结合制备带修饰的多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}；2.固相法制备多肽片段B：{Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}；3.通过自然链接法,在液相条件下将修饰的多肽片段A链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2；4.在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。其中：步骤1以Fmoc-Asp(otbu)-二氯树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Tyr(tbu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Boc-Cys(trt)-OH,得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-二氯树脂，经一次裂解得到全保护多肽Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-COOH，再液相缩合苄硫醇，得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-SBzl，再经二次裂解去除保护基，得到多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}。步骤2以RnikAmideAM树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Thr(tbu)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,得到NH2-Cys(trt)-Cys(trt)-Thr(tbu)-Gly-Ser(tbu)-Cys(trt)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Gly-Lys(boc)-Cys(trt)-RnikAmideAM树脂，裂解去除保护基，得到去保护多肽片段B：{Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}。步骤3将等摩尔比的多肽片段A和多肽片段B溶于pH=6.5-7.5的PBS溶液中，搅拌反应0.5-2小时，LCMS检测反应终点，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2。步骤4在齐考诺肽线性肽粗品溶液中加入氧化剂，搅拌反应2-12小时，HPLC监测反应终点，得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱制备纯化，真空冻干得到齐考诺肽精品。步骤5中，固相偶联每一个氨基酸，以DMF为溶剂，选择HBTU/NMM作为缩合剂；液相缩合苄硫醇，以DMF或NMP或DMF/NMP为溶剂，选择HBTU/NMM或HCTU/NMM中的一种为缩合剂，搅拌反应0.5-2小时；步骤5中，一次裂解液的配比为体积百分配比2%TFA/DCM，二次裂解液的配比（V%）组成为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水；步骤8中，固相偶联每一个氨基酸，以DMF为溶剂，选择HBTU/NMM作为缩合剂；裂解液的配比组成（V%）为：87.5%TFA+5%苯甲硫醚+2.5%乙二硫醇+2.5%苯酚+2.5%水。步骤11中所述的氧化剂为DMSO，浓度为1%-5%v/v。本专利技术中一些常用缩写具有以下含义：HBTU：O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于：包括以下步骤:（1）固液相结合制备带修饰的多肽片段A：{Cys‑Lys‑Gly‑Lys‑Gly‑Ala‑Lys‑Cys‑Ser‑Arg‑Leu‑Met‑Tyr‑Asp‑Sbzl}；（2） 固相法制备多肽片段B：{Cys‑Cys‑Thr‑Gly‑Ser‑Cys‑Arg‑Ser‑Gly‑Lys‑Cys‑NH2}；（3） 通过自然链接法，在液相条件下将修饰的多肽片段A 链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys‑Lys‑Gly‑Lys‑Gly‑Ala‑Lys‑Cys‑Ser‑Arg‑Leu‑Met‑Tyr‑Asp‑Cys‑Cys‑Thr‑Gly‑Ser‑Cys‑Arg‑Ser‑Gly‑Lys‑Cys‑NH2；（4）在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。

【技术特征摘要】
1.一种固液相结合制备齐考诺肽的方法，其特征在于：包括以下步骤:（1）固液相结合制备带修饰的多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}；（2）固相法制备多肽片段B：{Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2}；（3）通过自然链接法，在液相条件下将修饰的多肽片段A链接到多肽片段B上，制备得到齐考诺肽线性肽粗品溶液，即Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2；（4）在同一体系下加入氧化剂，氧化得到齐考诺肽粗品水溶液，再经高效液相色谱纯化冻干得到齐考诺肽精品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤（1）以Fmoc-Asp(otbu)-二氯树脂为固相载体，按照Fmoc固相合成法，依次偶联以下保护氨基酸：Fmoc-Tyr(tbu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Ser(tbu)-OH,Fmoc-Cys(trt)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Boc-Cys(trt)-OH,得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-二氯树脂，经一次裂解得到全保护多肽Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-COOH，再液相缩合苄硫醇，得到Boc-Cys(trt)-Lys(boc)-Gly-Lys(boc)-Gly-Ala-Lys(boc)-Cys(trt)-Ser(tbu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tbu)-Asp(otbu)-SBzl，再经二次裂解去除保护基，得到多肽片段A：{Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Sbzl}。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐红岩，竺剑峰，
申请(专利权)人：滨海吉尔多肽有限公司，上海吉尔多肽有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32