突变体孔制造技术

本发明专利技术涉及胞溶素的突变形式。本发明专利技术还涉及使用胞溶素的所述突变形式进行分析物表征。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变体孔
本专利技术涉及胞溶素(lysenin)的突变形式。本专利技术还涉及使用胞溶素的所述突变形式进行分析物表征。
技术介绍
纳米孔感测是一种依赖于对分析物分子与受体之间的单独结合或相互作用事件的观察的感测方法。可以通过在绝缘膜中放置纳米尺寸的单孔和测量在存在分析物分子的情况下通过所述孔的电压驱动的离子转运来产生纳米孔传感器。分析物的同一性通过其独特的电流特征揭露，尤其是电流块的持续时间和程度以及电流电平的变化。这种纳米孔传感器是可商购的，例如，由牛津纳米孔科技有限公司(OxfordNanoporeTechnologiesLtd)销售的MinIONTM装置，其包括集成在电子芯片内的纳米孔阵列。当前在广泛的应用范围内需要快速且便宜的核酸(例如，DNA或RNA)测序技术。现有技术缓慢且昂贵，这主要是因为其依赖于扩增技术以产生大量核酸并且需要大量专业荧光化学品以进行信号检测。纳米孔感测有可能通过降低所需核苷酸和试剂的量来提供快速且便宜的核酸测序。使用纳米孔感测对核酸进行测序的基本要素之一是控制核酸移动穿过孔。另一个要素是在核酸聚合物移动穿过孔时区分核苷酸。在过去，为了实现核苷酸区分，已经使核酸穿过溶血素的突变体。这已经提供了已经显示具有序列依赖性的电流特征。还已经显示，在使用溶血素孔时，大量核苷酸贡献于所观察到的电流，从而使得所观察到的电流与多核苷酸之间的直接关系具有挑战性。虽然已经通过溶血素孔突变提高了用于核苷酸区分的电流范围，但是如果可以进一步提高核苷酸之间的电流差异，则测序系统将具有更高的性能。另外，已经观察到，当核酸移动穿过孔时，一些电流状态显示出很高的变化。还已经显示，一些突变溶血素孔展现出比其它突变溶血素更高的变化。虽然这些状态的变化可能含有序列特异性信息，但是期望产生具有低变化的孔以简化系统。还期望降低贡献于所观察到的电流的核苷酸的数目。胞溶素(也称为efL1)是一种从蚯蚓赤子爱胜蚓的体腔液中纯化而来的成孔毒素。其特异性地结合到鞘磷脂，所述鞘磷脂抑制胞溶素诱导的溶血(Yamaji等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，1998年，第273卷，第9期，第5300到5306页)。在DeColbis等人，《结构(Structure)》，2012年，第20卷，第1498到1507页中公开了胞溶素单体的晶体结构。
技术实现思路
诸位专利技术人惊奇地发现了新的突变胞溶素单体，在所述单体中已经进行了一个或多个修饰以提高所述单体与多核苷酸相互作用的能力。诸位专利技术人还惊奇地证实，包括新颖突变单体的孔具有增强的与多核苷酸相互作用的能力并且因此显示出提高的用于估计多核苷酸的特性如其序列的性质。突变孔出人意料地显示出提高的核苷酸区分。具体地说，突变孔出人意料地显示出增大的电流范围和减少的状态变化，所述增大的电流范围使得更容易区分不同核苷酸，并且所述减少的状态变化增加信噪比。另外，在多核苷酸移动穿过所述孔时贡献于电流的核苷酸的数目减小。这使得更容易识别在多核苷酸移动穿过孔时的所观察到的电流与多核苷酸序列之间的直接关系。除非相反地陈述，否则本文所公开的所有氨基酸取代、缺失和/或添加均参考包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体的突变胞溶素单体。提及包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体的突变胞溶素单体涵盖包括如SEQIDNO：14到16中所述的序列的变异体的突变胞溶素单体。可以对包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体的胞溶素单体进行等同于本文中参考SEQIDNO：2公开的取代、缺失和/或添加的氨基酸取代、缺失和/或添加。突变单体可以被视为分离单体。因此，本专利技术提供了一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中所述单体能够形成孔，并且其中所述变异体包括以下位置中的一个或多个处的修饰：K37、G43、K45、V47、S49、T51、H83、V88、T91、T93、V95、Y96、S98、K99、V100、I101、P108、P109、T110、S111、K112以及T114。本专利技术还提供了一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中所述单体能够形成孔，并且其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：D35N/S；S74K/R；E76D/N；S78R/K/N/Q；S80K/R/N/Q；S82K/R/N/Q；E84R/K/N/A；E85N；S86K/Q；S89K；M90K/I/A；E92D/S；E94D/Q/G/A/K/R/S/N；E102N/Q/D/S；T104R/K/Q；T106R/K/Q；R115S；Q117S；以及N119S。本专利技术还提供了一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中所述单体能够形成孔，并且其中所述变异体包括以下中的一个或多个处的突变：D35/E94/T106；K37/E94/E102/T106；K37/E94/T104/T106；K37/E94/T106；K37/E94/E102/T106；G43/E94/T106；K45/V47/E92/E94/T106；K45/V47/E94/T106；K45/S49/E92/E94/T106；K45/S49/E94/T106；K45/E94/T106；K45/T106；V47/E94/T106；V47/V88/E94/T106；S49/E94/T106；T51/E94D/T106；S74/E94；E76/E94；S78/E94；Y79/E94；S80/E94；S82/E94；S82/E94/T106；H83/E94；H83/E94/T106；E85/E94/T106；S86/E94；V88/M90/E94/T106；S89/E94；M90/E94/T106；T91/E94/T106；E92/E94/T106；T93/E94/T106；E94/Y96/T106；E94/S98/K99/T106；E94/K99/T106；E94/E102；E94/T104；E94/T106；E94/P108；E94/P109；E94/T110；E94/S111；E94/T114；E94/R115；E94/Q117；以及E94/E119。本专利技术还提供了一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中所述单体能够形成孔，并且其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：E84R/E94D；E84K/E94D；E84N/E94D；E84A/E94Q；E84K/E94Q以及E94Q/D121S。本专利技术还提供了一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中所述变异体包括以下取代组合之一：-E84Q/E85K/E92Q/E94D/E97S/D126G；-E84Q/E85K/E92Q/E94Q/E97S/D126G；或-E84Q/E85K/E92Q/E94D/E97S/T106K/D126G。本专利技术还提供了一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中在所述变异体中，(a)SEQIDNO：2的位置34到70处或与那些位置相对应的氨基酸中的2个、4个、6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个或20个已经缺失，并且(b)SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变胞溶素单体，其包括SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的变异体，其中所述变异体包括以下位置中的一个或多个处的修饰：K37、G43、K45、V47、S49、T51、H83、V88、T91、T93、V95、Y96、S98、K99、V100、I101、P108、P109、T110、S111、K112以及T114。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.06 GB 1605899.2;2016.05.11 GB 1608274.51.一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列的变异体，其中所述变异体包括以下位置中的一个或多个处的修饰：K37、G43、K45、V47、S49、T51、H83、V88、T91、T93、V95、Y96、S98、K99、V100、I101、P108、P109、T110、S111、K112以及T114。2.根据权利要求1所述的突变单体，其中所述变异体包括以下位置中的一个或多个处的修饰：T91、V95、Y96、S98、K99、V100、I101以及K112。3.根据权利要求2所述的突变单体，其中所述修饰是使用丝氨酸(S)或谷氨酰胺(Q)进行的取代。4.根据权利要求2或3所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：T91S、V95S、Y96S、S98Q、K99S、V100S、I101S以及K112S。5.根据权利要求1所述的突变单体，其中所述变异体包括以下位置中的一个或多个处的修饰：K37、G43、K45、V47、S49、T51、H83、V88、T91、T93、Y96、S98、K99、P108、P109、T110、S111以及T114。6.根据权利要求5所述的突变单体，其中所述修饰是使用天冬酰胺(N)、色氨酸(W)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)进行的取代。7.根据权利要求5或6所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：K37N/W/S/Q、G43K、K45D/R/N/Q/T/Y、V47K/S/N、S49K/L、T51K、H83S/K、V88I/T、T91K、T93K、Y96D、S98K、K99Q/L、P108K/R、P109K、T110K/R、S111K以及T114K。8.根据权利要求5到7中任一项所述的突变单体，其中所述变异体包括以下位置组合中的一个或多个处的修饰：9.根据权利要求8所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代组合中的一个或多个：10.一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列的变异体，其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：D35N/S；S74K/R；E76D/N；S78R/K/N/Q；S80K/R/N/Q；S82K/R/N/Q；E84R/K/N/A；E85N；S86K/Q；S89K；M90K/I/A；E92D/S；E94D/Q/G/A/K/R/S/N；E102N/Q/D/S；T104R/K/Q；T106R/K/Q；R115S；Q117S；以及N119S。11.根据权利要求10所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：E94D/Q/G/A/K/R/S、S86Q以及E92S。12.根据权利要求10所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代中的一个或多个：D35N/S；S74K/R；E76D/N；S78R/K/N/Q；S80K/R/N/Q；S82K/R/N/Q；E84R/K/N/A；E85N；S86K；S89K；M90K/I/A；E92D；E94D/Q/K/N；E102N/Q/D/S；T104R/K/Q；T106R/K/Q；R115S；Q117S；以及N119S。13.根据权利要求12所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代组合中的一个或多个：14.一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列的变异体，其中所述变异体包括在以下位置组合中的一个或多个处的突变：15.根据权利要求14所述的突变单体，其中所述变异体包括以下取代组合中的一个或多个：16.一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列的变异体，其中所述变异体包括以下取代对中的一个或多个：E84R/E94D；E84K/E94D；E84N/E94D；E84A/E94Q；E84K/E94Q以及E94Q/D121S。17.根据前述权利要求中任一项所述的突变胞溶素单体，其中所述单体包括任何数目个在前述权利要求中任一项所定义的修饰和/或取代以及其任何组合。18.一种突变胞溶素单体，其包括SEQIDNO：2中所示的序列的变异体，其中在所述变异体中，(a)与SEQIDNO：2的位置34到70处的氨基酸相对应的氨基酸中的2个、4个、6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个或20个已经缺失，并且(b)与SEQIDNO：2的位置71到107处的氨基酸相对应的氨基酸中的2个、4个、6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个或20个已经缺失。19.根据权利要求18所述的突变单体，其中在(a)和(b)中已经缺失了相同数目个氨基酸。20.根据权利要求18或19所述的突变体，其中已经缺失的所述氨基酸的位置在表1或表2的一行中或表1和/或表2的多于一行中示出。21.根据权利要求18到20中任一项所述的突变单体，其中与SEQIDNO：2中的以下氨基酸相对应的氨基酸已经缺失：(i)N46/V47/T91/T92；或(ii)N48/S49/T91/T92。22.根据权利要求18到21中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉科马·贾亚辛格，马克·布鲁斯，卢克·麦克尼尔，拉米兹·伊克巴尔·纳撒尼，普拉提克·拉吉·辛格，尼尔·罗杰·伍德，斯蒂芬·罗伯特·杨，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB