一种检测细胞内质网内pH的双光子荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞内质网内pH的荧光探针：

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞内质网内pH的双光子荧光探针
本专利技术涉及用于细胞内pH检测的新型荧光探针及其应用，属于小分子荧光材料领域。
技术介绍
内质网作为细胞重要的细胞器，是细胞质中由膜组成的一系列片状的囊腔和管状的腔，由粗而内质网和滑而内质网两部分组成.内质网在细胞中将细胞核、细胞质、细胞膜有机的连接成一个整体，负责物质在细胞中的转运，同时也是蛋白质、脂类、糖类等的合成基地.膜分泌性蛋白、磷脂、氨基多糖、胆固醇、钙信号等的代谢均和细胞内质网的功能直接相关.此外，病毒感染，氨基酸剥夺，蛋白表达异常，氧化剂、还原剂、钙调节异常等应激都可导致未折叠蛋白质在内质网中积累，进而诱发神经退行性疾病、心脏病、糖尿病和癌症等疾病.因此，实时跟踪内质网构型变化，以及其中各类活性生物小分子水平，对于掌握内质网复杂生理功能过程及与内质网相关疾病的病理机制具有重要意义内质网（ER）作为必需的细胞器在钙稳态，脂质合成和折叠以及膜和分泌蛋白的成熟中起重要作用。当ER的正常功能受到各种条件的干扰时，例如葡萄糖毒性，ER中的Ca2+失衡，缺血和缺氧，自由基，蛋白质合成增加，ER应激将出现。最近，许多研究表明ER应激在许多代谢疾病的发展中起着至关重要的作用，包括肥胖，胰岛素抵抗和糖尿病。例如，ER应激的标志物在糖尿病动物中升高，并且操纵ER应激反应的组分的治疗策略将改善糖尿病环境中的正常功能。这表明靶向ER应激可能是预防或减弱相应疾病发展的可行治疗选择。细胞内pH在许多细胞事件中起重要作用，例如细胞生长，细胞凋亡，离子转运，自噬，酶活性，体内平衡和其他细胞过程。特别地，对于ER作为重要参数的pH，对于调节该细胞器的正常生理功能是重要的。大量研究表明，ER应激可引发自噬，导致ER酸化。作为动态平衡的扰动，ER酸化过程与ER应激诱发疾病的进展密切相关。因此，由于ER中pH酸化的生理意义，实时观察ER内部pH变化具有重要意义。应用于阐明细胞代谢，并深入了解相关疾病的发病机制。荧光成像正在成为监测生命系统中各种生物活性分子的有前途和有力手段，这得益于其显着的优势，如操作简便，灵敏度高，时间-空间高分辨率。具体而言，双光子荧光显微成像是一种利用近红外激光脉冲的迷人方法，其具有许多优点，包括更深的组织穿透，更高的空间分辨率和最小的背景发射，以及更长的观察时间。因此，近年来已经报道了许多具有用于各种生物活性分子的单光子或双光子特性的荧光探针，这促进了细胞生物学和治疗成像的进展。其中，已经提出了许多pH响应传感器，它们在一定程度上揭示了pH的化学生物学。并且，本文提出适用于ER中pH值成像的荧光探针，实时可视化ER酸化的荧光探针，具有更加重大的意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的定位内质网荧光探针少、合成步骤繁琐、成本高等问题，本专利技术提供一种细胞内质网靶向的检测pH的双光子荧光探针，特异性高、不受干扰。本专利技术的另一目的是提供上述双光子荧光探针的合成方法，原料廉价易得，制备成本低。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测细胞内质网内pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：式（I）。一种上述荧光探针的合成方法，采用以下步骤：（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺在乙醇中加热回流，产物分离纯化后得化合物1：；（2）化合物1与三氟乙酸在二氯甲烷中室温反应，产物分离纯化得化合物2：；（3）化合物2与对甲基苯磺酰氯在二氯甲烷中低温反应，产物分离纯化后得化合物3：；（4）化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚加热回流反应，产物分离纯化得荧光探针。步骤（1）中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺的摩尔比为1-1.2:1。步骤（1）中，加热温度为80℃；反应时间为4-6小时。步骤（1）中，所述分离纯化步骤为抽滤后的固体以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。步骤（2）中，所述化合物1与三氟乙酸的摩尔比为1:1-1.5。步骤（2）中，所述反应时间为2-5小时。步骤（2）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以甲醇：二氯甲烷=15:1（v/v）为淋洗液过硅胶层析柱。步骤（3）中，所述化合物1与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2。步骤（3）中，反应温度为-5-0℃；反应时间为2-6小时。步骤（3）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以二氯甲烷：甲醇=100:1（v/v）过硅胶柱层析。步骤（4）中，化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚的摩尔比为1:1-1.2。步骤（4）中，反应温度为110℃，反应时间为3-6小时。步骤（4）中，所述分离纯化步骤为干燥得粗产物，再以二氯甲烷：甲醇=10:1（v/v）过硅胶层析柱。一种上述双光子荧光探针在检测溶液、细胞或组织内内质网pH的应用。优选的，上述应用中，单光子荧光成像中激发波长为405nm，发射波段为500-550nm；双光子荧光成像中激发波长为800nm，发射波段为500-550nm。本专利技术具有以下优点：本专利技术所述的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本专利技术所述的荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞内质网pH的实时测定，具有广阔的应用前景。由于该荧光探针具有双光子性质，可用于组织内活细胞内质网pH的实时测定。本专利技术所述的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性，通过绘制标准曲线进行细胞内质网pH的测定，可以实现对细胞内质网pH快速准确检测的目的。附图说明图1是荧光探针的1HNMR图谱；图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱；图3是荧光探针与不同pH的线性关系数据；图4是荧光探针对不同物质的选择性；图5是荧光探针与内质网ER-traker探针的细胞共定位图像；图6是荧光探针检测组织活细胞中pH的生物成像图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐（1mmol）溶于25mL乙醇中回流加热至全部溶解后，将BOC-乙二胺（1mmol）溶于2mL乙醇后滴加至反应液中，继续回流搅拌4小时，抽滤得白色固体，以乙酸乙酯：石油醚=3:1（v/v）为淋洗液进行柱层析，得化合物1；（2）将上述化合物1全部溶于20mL二氯甲烷中，滴加2.5mL的三氟乙酸，室温下搅拌3小时。旋干后，以甲醇：二氯甲烷=15:1（v/v）为淋洗液进行柱层析，得到化合物2；（3）将化合物2（0.5mmol）溶于15mL二氯甲烷中，冰盐浴下（-5℃）将对甲基苯磺酰氯（0.5mmol）的二氯甲烷溶液滴加到上述溶液中，搅拌3小时后旋干，以二氯甲烷：甲醇=100:1（v/v）为淋洗液进行柱层析，得到化合物3；（4）将化合物3（0.5mmol）与1-(2-羟乙基)哌嗪（0.5mmol）溶于5mL乙二醇甲醚中，110℃回流5小时后旋干，以二氯甲烷：甲醇=10:1（v/v）为淋洗液进行柱层析得到荧光探针；其1HNMR图谱见图1。各步骤反应式如下：。实施例2荧光探针对不同pH环境的响应将实施例1中获得的探针，用乙醇溶解后，以水稀释成10μM探针缓冲溶液（含10%乙醇）。取13份上述探针溶液，分别加入相同体积pH缓冲溶液，使pH依次为4.0，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测细胞内质网内pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞内质网内pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺在乙醇中加热回流，产物分离纯化后得化合物1：；（2）化合物1与三氟乙酸在二氯甲烷中室温反应，产物分离纯化得化合物2：；（3）化合物2与对甲基苯磺酰氯在二氯甲烷中低温反应，产物分离纯化后得化合物3：；（4）化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚加热回流反应，产物分离纯化得荧光探针。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐与BOC-乙二胺的摩尔比为1-1.2:1；化合物1与三氟乙酸的摩尔比为1:1-1.5；化合物1与对甲基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.2；化合物3与1-（2-羟乙基）哌嗪在乙二醇甲醚的摩尔比为1:1-1.2。...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，张楠，董宝利，孔秀琪，宋文辉，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37